Biologia Celular e Molecular - Biologia Celular (2025)

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<p>■</p><p>■</p><p>■</p><p>■</p><p>■</p><p>■</p><p>Os autores deste livro e a editora empenharam seus melhores esforços para assegurar que as informações e os procedimentos</p><p>apresentados no texto estejam em acordo com os padrões aceitos à época da publicação, e todos os dados foram atualizados pelos</p><p>autores até a data do fechamento do livro. Entretanto, tendo em conta a evolução das ciências, as atualizações legislativas, as</p><p>mudanças regulamentares governamentais e o constante fluxo de novas informações sobre os temas que constam do livro,</p><p>recomendamos enfaticamente que os leitores consultem sempre outras fontes fidedignas, de modo a se certificarem de que as</p><p>informações contidas no texto estão corretas e de que não houve alterações nas recomendações ou na legislação regulamentadora.</p><p>Data do fechamento do livro: 20/01/2023.</p><p>Atendimento ao cliente: (11) 5080-0751 | faleconosco@grupogen.com.br</p><p>© 2023 by</p><p>Editora Guanabara Koogan Ltda.</p><p>Uma editora integrante do GEN | Grupo Editorial Nacional S/A</p><p>Travessa do Ouvidor, 11</p><p>Rio de Janeiro – RJ – CEP 20040-040</p><p>grupogen.com.br</p><p>Capa: Bruno Sales</p><p>Ficha catalográfica</p><p>CIP-BRASIL. CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO</p><p>SINDICATO NACIONAL DOS EDITORES DE LIVROS, RJ</p><p>J94b</p><p>10. ed</p><p>Junqueira, L. C.</p><p>Biologia celular e molecular / L. C. Junqueira, José Carneiro ; organização C.Y. Irene Yan, Nathalie Cella. - 10. ed. - Rio de</p><p>Janeiro : Guanabara Koogan, 2023.</p><p>: il. ; 28 cm.</p><p>Inclui bibliografia e índice</p><p>ISBN 978-85-277-3934-4</p><p>1. Citologia. 2. Biologia molecular. I. Carneiro, José. II. Yan, C. Y. Irene. III. Cella, Nathalie. IV. Título.</p><p>23-81947</p><p>CDD: 571.6</p><p>CDU: 576</p><p>Gabriela Faray Ferreira Lopes - Bibliotecária - CRB-7/6643</p><p>mailto:faleconosco@grupogen.com.br</p><p>http://www.grupogen.com.br/</p><p>Colaboradores</p><p>Alicia Kowaltowski</p><p>Graduada em Medicina pela Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Doutora em Ciências Médicas pela</p><p>Unicamp. Pós-Doutorado na Oregon Graduate Institute, EUA. Professora Titular do Departamento de</p><p>Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo (IQ-USP). Membro da Academia Brasileira de</p><p>Ciências (ABC).</p><p>Carolina Beltrame Del Debbio</p><p>Graduada em Enfermagem pela Universidade de São Paulo (USP). Doutora em Ciências, Biologia Celular e</p><p>Tecidual pela USP. Pós-Doutorado na USP e na University of Nebraska Medical Center, EUA. Professora</p><p>Doutora do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do Instituto de Ciências Biomédicas da</p><p>USP (ICB-USP).</p><p>Fábio Siviero</p><p>Graduado em Química pela Universidade de São Paulo (USP). Doutor em Bioquímica pela USP. Pós-Doutorado</p><p>na USP. Professor Doutor do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do Instituto de Ciências</p><p>Biomédicas da USP (ICB-USP).</p><p>Fernanda Ortis</p><p>Graduada em Biologia pelo Instituto de Biologia da Universidade de São Paulo (USP). Doutora em Bioquímica</p><p>pelo Instituto de Química da USP. Pós-Doutorado na Université Libre de Bruxelles, Bélgica. Professora Doutora</p><p>do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do Instituto de Ciências Biomédicas da USP (ICB-</p><p>USP).</p><p>Marinilce Fagundes dos Santos</p><p>Graduada em Odontologia pela Universidade Estadual Paulista (UNESP). Mestre em Fisiologia Humana pela</p><p>Universidade de São Paulo (USP) e Doutora em Biologia Celular e Tecidual pela USP. Pós-Doutorado na</p><p>University of Tennessee, EUA e no National Institute of Craniofacial Research, EUA. Livre-Docente pelo</p><p>Instituto de Ciências Biomédicas da USP (ICBUSP). Professora Titular do Departamento de Biologia Celular e</p><p>do Desenvolvimento do ICB-USP. Membro da Sociedade Brasileira de Biologia Celular (SBBC).</p><p>Patricia Pereira Coltri</p><p>Graduada em Biologia pela Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Mestre e Doutora em Genética e</p><p>Biologia Molecular pela Unicamp. Pós-Doutorado na USP e no University of California at Santa Cruz, EUA.</p><p>Livre-Docente pelo Instituto de Ciências Biomédicas da USP (ICB-USP). Professora Associada do</p><p>Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do ICB-USP. Membro da Sociedade Brasileira de</p><p>Biologia Celular (SBBC) e da RNA Society.</p><p>Agradecimentos</p><p>Gostaríamos de agradecer a dois de nossos mestres: Prof. José Carneiro, por nos ensinar que a redação de um</p><p>livro didático requer um carinho especial; e ao conjunto de todos os nossos alunos, que nos ensinam sempre</p><p>como lecionar.</p><p>Finalmente, agradecemos a toda a equipe do Grupo Editorial Nacional (GEN) pelo empenho e pela paciência</p><p>com o nosso aprendizado durante a edição desta obra.</p><p>Chao Yun Irene Yan</p><p>Nathalie Cella</p><p>Prefácio à 10a edição</p><p>Biologia Celular e Molecular nasceu em 1972, quando os conhecimentos sobre essas duas áreas eram</p><p>primariamente morfológicos. Desde então, graças aos avanços dos métodos científicos e da tecnologia, hoje</p><p>conhecemos muito mais sobre o funcionamento das células. Nesta nova edição, reunimos uma equipe singular de</p><p>pesquisadores e docentes na área de biologia celular e molecular, a fim de transmitir ao leitor o dinamismo da</p><p>célula e dos tecidos vivos. Todos nós pesquisamos e lecionamos. Por isso, reconhecemos a importância de</p><p>manter a didática fantástica dos professores Junqueira e Carneiro para comunicar as descobertas mais recentes.</p><p>Esperamos, assim, fazer jus ao legado da obra e despertar a paixão por essa área, que toda a equipe nutre.</p><p>Chao Yun Irene Yan</p><p>Nathalie Cella</p><p>Prefácio à 1a edição</p><p>Citologia Básica apresenta as informações fundamentais e as descobertas mais recentes sobre a biologia celular,</p><p>que interessam aos estudantes dos cursos de História Natural, Medicina, Odontologia, Veterinária e outras</p><p>ciências biomédicas. Antes de começar a escrever este livro, escolhemos três características básicas e julgamos</p><p>que o resultado está de acordo com nosso plano inicial. Ele é conciso, atualizado e abundantemente ilustrado.</p><p>No Capítulo 1 apresentamos uma visão geral, panorâmica, das células. Esse capítulo é quase um resumo do</p><p>livro. Sua finalidade é estabelecer um arcabouço sólido, sobre o qual serão depois introduzidas as minúcias da</p><p>estrutura e do funcionamento das células. No Capítulo 2 descrevemos os métodos de trabalho empregados em</p><p>Citologia. Dados sobre a organização molecular das células, essenciais à compreensão do restante do livro, estão</p><p>contidos no Capítulo 3, enquanto nos Capítulos 4 a 10 descrevemos as principais funções celulares, evitando</p><p>estabelecer uma separação entre morfologia e função. Em vez de estudar as organelas isoladamente (aparelho de</p><p>Golgi, mitocôndrias etc.), estudamos cada função celular, descrevendo ao mesmo tempo os elementos estruturais</p><p>que nela tomam parte. A diferenciação celular é estudada no Capítulo 11. A célula vegetal, os vírus, as células</p><p>procariontes e as células cancerosas são descritos nos quatro capítulos finais.</p><p>Nossa preocupação principal foi elaborar um livro de texto em linguagem simples, moderno e adequado aos</p><p>programas de Citologia das diversas faculdades brasileiras. Limitamo-nos ao estudo das manifestações da</p><p>atividade celular suscetíveis de serem aprendidas por métodos morfológicos e citoquímicos. Embora</p><p>compreendendo que a delimitação do campo da Citologia é praticamente impossível, evitamos entrar no terreno</p><p>da Bioquímica e da Genética, mantendo as informações sobre essas duas disciplinas dentro do mínimo</p><p>absolutamente necessário para a compreensão da fisiologia celular. O Capítulo 3, com alguns dados bioquímicos,</p><p>foi incluído porque muitos cursos de Citologia são ministrados antes dos cursos de Bioquímica. Evitando a</p><p>duplicação de assuntos ensinados em outras disciplinas, conseguimos elaborar um livro de tamanho adequado à</p><p>extensão dos cursos de Citologia ministrados nas universidades brasileiras.</p><p>L. C. Junqueira</p><p>José Carneiro</p><p>Material Suplementar</p><p>Este livro conta com o seguinte material suplementar:</p><p>■ Ilustrações da obra em formato de apresentação (restrito a docentes).</p><p>O acesso ao material suplementar é gratuito. Basta que o docente se cadastre, faça seu login em nosso site</p><p>(www.grupogen.com.br) e, após, clique em Ambiente de aprendizagem.</p><p>O acesso ao material suplementar online fica disponível até seis meses após a edição do</p><p>cada ligação formada.</p><p>Isomeria óptica em aminoácidos</p><p>Algumas estruturas apresentam algumas assimetrias, o que promove duas possibilidades</p><p>conformacionais para cada assimetria, como uma imagem em um espelho, que não se</p><p>sobrepõe ao objeto refletido por nenhuma forma de reorientação, ou nossas mãos, que</p><p>também não são sobreponíveis. Essa propriedade é conhecida como quiralidade.</p><p>Compostos químicos também podem apresentar centros quirais (centros de assimetria),</p><p>com formas que não podem ser justapostas. Cada versão dessas moléculas é denominada</p><p>“enantiômero”. O carbono alfa dos aminoácidos é um centro quiral (conhecido como carbono</p><p>quiral), exceto em glicina, que propicia duas possibilidades de enantiômeros.</p><p>As propriedades químicas e físicas dos enantiômeros são essencialmente iguais, porém</p><p>interagem de maneiras diferentes com luz polarizada e com outras substâncias quirais.</p><p>Biomoléculas frequentemente apresentam quiralidade, logo, enantiômeros de origem</p><p>biológica se relacionarão de modo específico com outras substâncias quirais ou com</p><p>catalisadores (enzimas), também quirais. Essas relações são de especial interesse clínico e</p><p>farmacológico, sendo bastante comum a necessidade de obtenção de um enantiômero</p><p>purificado como fármaco, já que pode apresentar a ação fisiológica desejada e sua</p><p>contraparte não ter efeito algum, ou efeito adverso.</p><p>A síntese química usual de uma substância com centro quiral geralmente produz uma</p><p>mistura racêmica, ou seja, contendo partes iguais de todos os enantiômeros possíveis. No</p><p>entanto, biomoléculas dotadas de centros quirais de origem biológica são quase sempre</p><p>produzidas na forma de um enantiômero puro.</p><p>Quase todos os aminoácidos celulares usuais (exceto a glicina) são enantiômeros levógiros</p><p>(L-aminoácidos, desviam a luz polarizada para a esquerda), o que reforça a hipótese,</p><p>apresentada no Capítulo 1, segundo a qual todas as células hoje existentes derivam de uma</p><p>célula ancestral única. Esta teria se desenvolvido aproveitando os L-aminoácidos, sendo a</p><p>capacidade de utilizá-los transmitida a todas as células descendentes.</p><p>As proteínas são os componentes químicos mais variados da célula, em virtude de serem constituídas de 20</p><p>aminoácidos diferentes. Essa diversificação estrutural reflete-se nas múltiplas funções biológicas que proteínas</p><p>podem exercer. Essas macromoléculas têm importante função bioquímica (como enzimas), estrutural (nos</p><p>filamentos intermediários, microfilamentos e microtúbulos), na comunicação celular (nos hormônios proteicos e</p><p>em seus receptores), no movimento das células (exemplificado pela atividade motora do complexo actina–</p><p>miosina) e, finalmente, uma pequena importância como fonte energética. Note que quase a totalidade da energia</p><p>consumida pelas células é fornecida pelas moléculas de lipídios e carboidratos.</p><p>As proteínas podem ser classificadas em duas categorias: as proteínas simples, cujas moléculas são formadas</p><p>exclusivamente por aminoácidos, e as proteínas conjugadas, cujas moléculas combinam-se a uma parte não</p><p>proteica denominada “grupo prostético” (Tabela 2.2). O grupo prostético pode estar ligado à proteína por ligação</p><p>covalente ou interações mais fracas e transitórias.</p><p>A carga elétrica das proteínas depende dos grupos NH2, COOH e imidazol (cadeia lateral da histidina)</p><p>ionizáveis dos aminoácidos que as compõem e do pH do ambiente em que elas se encontram. Essas</p><p>características condicionam a sua migração em um campo elétrico, por exemplo, ou definem interações</p><p>eletrostáticas entre proteínas (receptores e ligantes). Em um ambiente fisiológico (pH ≈ 7,4), dependendo da</p><p>predominância de grupos NH2 ou COOH, as proteínas são básicas ou ácidas, respectivamente; por exemplo, as</p><p>histonas, ricas em lisina e arginina (aminoácidos com dois grupos NH2 por molécula), são eletricamente</p><p>positivas, portanto, básicas e, por isso, combinam-se aos grupos fosfato do DNA para formar complexas</p><p>nucleoproteínas.</p><p>Tabela 2.2 Exemplos de proteínas conjugadas e seus respectivos grupos prostéticos.</p><p>Proteína conjugada Grupo prostético</p><p>Nucleoproteína Ácidos nucleicos</p><p>Glicoproteínas Polissacarídios</p><p>Lipoproteínas Lipídios</p><p>Fosfoproteínas Grupo(s) fosfato</p><p>Hemeproteínas (catalases,</p><p>peroxidases e citocromos)</p><p>Grupo heme (constituído por um átomo de ferro em um</p><p>anel orgânico)</p><p>Flavoproteínas Riboflavina(s)</p><p>Metaloproteínas Metal ou um composto inorgânico que contém metal.</p><p>Exemplo: ferritina, contendo o grupo prostético Fe(OH)3</p><p>A sequência de aminoácidos influi na forma e função das proteínas</p><p>As proteínas são a classe de macromoléculas mais versátil dos seres vivos. Com apenas 20 aminoácidos e vários</p><p>graus de organização tridimensional, elas apresentam uma vasta variedade de formas e propriedades físico-</p><p>químicas, podendo realizar funções estruturais, catalíticas, de transporte, entre outras.</p><p>Conforme exposto anteriormente, as biomoléculas assumem uma forma tridimensional específica em</p><p>ambiente aquoso. Esse aspecto é muito importante em sistemas biológicos, pois dentro da célula, em condições</p><p>fisiológicas, a estrutura das moléculas determina suas atividades e interações. A configuração nativa das</p><p>proteínas é a forma tridimensional única em que se apresenta no pH e na temperatura existentes nos organismos</p><p>vivos (Figura 2.5).</p><p>A quantidade e a sequência dos resíduos de aminoácidos em uma cadeia polipeptídica estabelecem a</p><p>estrutura primária da proteína que é mantida por ligações peptídicas. Se essas ligações químicas fossem as</p><p>únicas existentes, as moléculas das proteínas seriam dobradas ao acaso, irregularmente, entretanto, o estudo das</p><p>propriedades das proteínas em estado nativo revela que elas são constituídas por cadeias polipeptídicas dobradas</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>de maneira bastante regular e constante para cada tipo de proteína, indicando a existência de outras interações</p><p>envolvidas em sua conformação.</p><p>As cadeias dobram-se e enovelam-se de modo complexo, para constituírem um arranjo espacial definido e</p><p>típico da proteína – sua estrutura secundária.</p><p>Figura 2.5 Na parte superior, à esquerda, aparece uma proteína globular, em sua configuração nativa</p><p>(forma da molécula nas condições naturais dentro da célula). No centro, a mesma molécula, porém,</p><p>desnaturada. Como a desnaturação é frequentemente reversível, a molécula pode voltar à sua forma</p><p>inicial, como mostra a figura na parte inferior, à direita. As pequenas faixas laranja representam os</p><p>radicais que se unem para estabelecer a configuração nativa da proteína.</p><p>A estrutura tridimensional das proteínas pode ser mantida pelas seguintes forças de estabilização:</p><p>Ligação peptídica (resultante de ligação covalente)</p><p>Interação hidrofóbica</p><p>Pontes de hidrogênio</p><p>Ligações dissulfeto ou pontes dissulfeto (ligações covalentes entre moléculas do aminoácido cisteína).</p><p>Uma estrutura secundária muito frequente entre as proteínas globulares que formam a maioria das proteínas</p><p>da célula é a alfa-hélice (Figura 2.6). Essa configuração deve-se à formação de pontes de hidrogênio entre</p><p>aminoácidos de uma mesma cadeia, a qual adquire a forma de saca-rolha ou hélice. Outra estrutura secundária</p><p>comum é a folha-beta (ou folha-beta pregueada; ver Figura 2.6), na qual o arranjo compacto de segmentos de</p><p>cadeias peptídicas, em disposição paralela ou antiparalela, origina uma forma quase plana (geralmente torcida).</p><p>Figura 2.6 Estruturas secundárias (alfa-hélice e folha-beta) de uma proteína. As pontes de hidrogênio</p><p>entre os aminoácidos estão representadas por linhas pontilhadas. (Adaptada de CNX OpenStax,</p><p>2016. Disponível em: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:OSC_Microbio_07_04_secondary.jpg.)</p><p>Fatores determinantes para as estruturas secundárias</p><p>As estruturas secundárias são mantidas em conformação estável por diferentes interações</p><p>intramoleculares. Um importante componente que promove a estabilização das estruturas</p><p>proteicas é o posicionamento adequado de pontes de hidrogênio, que, como discutido</p><p>anteriormente, são capazes de formar interações suficientemente fortes e de modo</p><p>orientado. Há também forte contribuição das características</p><p>físico-químicas dos aminoácidos</p><p>componentes da proteína, tais como ângulos de ligações covalentes em torno da ligação</p><p>peptídica, os quais não podem assumir qualquer posição devido a impedimentos estéricos</p><p>geralmente envolvendo cadeias laterais, bem como por interações entre cadeias laterais, que</p><p>possibilitam intensas interações eletrostáticas e hidrofóbicas.</p><p>Para uma proteína assumir uma conformação nativa, esse processo deve ser</p><p>termodinamicamente favorável, pois o enovelamento (ver Capítulo 13) promove a redução da</p><p>energia livre e da entropia dessa macromolécula a cada passo. Por exemplo, de acordo com</p><p>as propriedades de cada aminoácido é possível definir sua tendência em ser parte de uma</p><p>alfa-hélice, ou seja, é possível calcular a energia livre de cada aminoácido nessa conformação.</p><p>Assim tem-se uma classificação dos aminoácidos mais propensos a formar essa estrutura</p><p>secundária (metionina, alanina, leucina, glutamato e lisina), bem como os aminoácidos com</p><p>maior tendência de perturbar esse arranjo (prolina e glicina).</p><p>Prever a estrutura secundária com base na sequência de aminoácidos é um desafio muito</p><p>grande ainda. Métodos computacionais atuais consideram características do solvente e a</p><p>https://commons.wikimedia.org/wiki/File:OSC_Microbio_07_04_secondary.jpg</p><p>hidrofobicidade de cada aminoácido, mas a eficiência dessas técnicas ainda não possibilita a</p><p>substituição de metodologia de análises de proteína com base em cristalografia, difração de</p><p>raios X e ressonância magnética nuclear.</p><p>A cadeia que contém a estrutura secundária dobra-se novamente sobre si mesma, formando estruturas</p><p>globulares ou alongadas, adquirindo, assim, uma estrutura terciária (Figura 2.7). Diz-se que uma proteína é</p><p>globular quando a sua molécula tem uma relação comprimento–largura menor que 10:1. A maioria das proteínas</p><p>das células é globular, como a hemoglobina, a mioglobina, a hemocianina, as proteínas com atividade enzimática</p><p>e as proteínas das membranas celulares. Quando a relação comprimento–largura é maior que 10:1, a proteína é</p><p>definida como fibrosa. Dentre as proteínas fibrosas intracelulares, a queratina é a mais bem estudada. A proteína</p><p>mais abundante no corpo dos mamíferos é o colágeno, proteína fibrosa extracelular que constitui as fibrilas</p><p>colágenas.</p><p>Figura 2.7 Esquema das estruturas primária, secundária e terciária de uma proteína. Na fita azul</p><p>estão representados os resíduos de aminoácidos (estrutura primária) e a hélice formada por eles</p><p>(estrutura secundária). As dobras da molécula, demonstradas por seu contorno externo, em verde,</p><p>constituem a estrutura terciária.</p><p>Muitas proteínas têm moléculas compostas por várias cadeias peptídicas, que podem ser iguais ou diferentes.</p><p>Essas cadeias chamam-se subunidades ou monômeros, sendo essas proteínas denominadas “oligoméricas”. O</p><p>modo específico de as subunidades se associarem para formar a proteína tem o nome de estrutura quaternária</p><p>(Figura 2.8). Essa estrutura é mantida graças à cooperação de numerosas ligações químicas fracas, como as</p><p>pontes de hidrogênio. Por meio da organização proteica quaternária, são criadas variadas estruturas de grande</p><p>importância biológica, como os microtúbulos, os microfilamentos, os capsômeros dos vírus e os complexos</p><p>enzimáticos que serão descritos adiante, neste capítulo.</p><p>A partir do exposto neste tópico, é possível concluir que a configuração tridimensional de uma proteína</p><p>também está relacionada com a quantidade de cadeias polipeptídicas que constituem sua molécula.</p><p>Chaperonas auxiliam no enovelamento de peptídios complexos e na</p><p>destruição de proteínas defeituosas</p><p>A estrutura tridimensional das proteínas em estado nativo depende de modificações conformacionais, que por sua</p><p>vez subordinam-se a propriedades bioquímicas definidas pela sua sequência de aminoácidos. As modificações</p><p>conformacionais também são conhecidas como enovelamento. Muitas proteínas apresentam enovelamento</p><p>espontâneo durante sua síntese, sofrendo dobras e curvaturas, aproximando regiões hidrofóbicas e expondo</p><p>porções polares, até que a conformação de menor energia seja alcançada, no entanto, proteínas de maior peso</p><p>molecular e complexidade necessitam de auxílio para atingir seu estado nativo ideal.</p><p>Mesmo proteínas nascentes ou recém-sintetizadas podem manter-se em um estado intermediário ou em uma</p><p>conformação incorreta, ou proteínas já maduras podem perder sua conformação estrutural (desnaturação). Em</p><p>todos esses cenários, proteínas intituladas chaperonas moleculares atuam proporcionando um microambiente</p><p>hidrofóbico onde os peptídios possam ser estabilizados enquanto são sintetizados, ou desnaturados e renaturados,</p><p>até alcançarem sua conformação nativa.</p><p>Figura 2.8 Diferentes subunidades proteicas (monômeros) podem associar-se para compor a</p><p>proteína madura. Nessa ilustração, a estrutura quaternária da chaperonina mitocondrial humana</p><p>mHSP60 está representada em duas projeções, composta por sete monômeros iguais; suas</p><p>subunidades estão representadas por cores diferentes e formam uma estrutura cilíndrica.</p><p>No ambiente intracelular, há grande concentração de proteínas em variados estágios de maturação, incluindo</p><p>aquelas que não estão completamente enoveladas, expondo seus domínios hidrofóbicos. Essas porções</p><p>hidrofóbicas em meio aquoso tendem a formar agregados insolúveis frequentes entre diferentes proteínas. As</p><p>chaperonas impedem a agregação indevida das cadeias polipeptídicas nascentes, além de desfazer as defeituosas</p><p>e promover a eliminação, por hidrólise, das proteínas incorretamente formadas. Para realizar essas tarefas, as</p><p>chaperonas utilizam energia fornecida por trifosfato de adenosina (ATP).</p><p>As chaperonas mais estudadas são denominadas “HSP60” e “HSP70”, com homólogos em procariotos e em</p><p>eucariotos. A abreviatura provém de heat shock protein, porque elas aumentam sua concentração quando as</p><p>células são expostas a temperaturas elevadas, e o número indica o peso molecular expresso em kilodáltons (kDa).</p><p>Existem também outras chaperonas de diferentes massas moleculares, de expressões constitutivas, e até mesmo</p><p>específicas para organelas.</p><p>Enzimas viabilizam o metabolismo celular</p><p>As enzimas são proteínas com atividade catalítica, ou seja, capazes de acelerar reações químicas específicas pela</p><p>redução da energia de ativação do processo. Sua atividade depende de sua estrutura tridimensional e pode ocorrer</p><p>por mecanismos distintos, por exemplo, na estabilização de estados intermediários de uma reação, fornecendo</p><p>uma via alternativa para a reação ou desestabilizando seu substrato. Enzimas atuam tanto no metabolismo</p><p>anabólico (síntese) como no catabólico (degradação de moléculas). São elas as principais responsáveis pela</p><p>eficiência da bioquímica intracelular. Graças às enzimas, as células executam em milésimos de segundo a síntese</p><p>de moléculas que, in vitro, sem enzimas, necessitariam de muitos anos para que esse processo acontecesse</p><p>espontaneamente.</p><p>Além da rapidez, as sínteses enzimáticas apresentam alto rendimento, isso é, no final da reação gera-se</p><p>apenas o produto desejado ou alguns produtos. Sendo catalisadores tão eficientes, as enzimas têm sido usadas</p><p>para síntese in vitro, tanto no laboratório experimental como na produção industrial. De fato, estão presentes</p><p>também no dia a dia de todos, sendo facilmente encontradas em produtos de limpeza, remédios e cosméticos.</p><p>Embora praticamente todas as enzimas sejam proteínas, há alguns RNAs, denominados “ribozimas”, que</p><p>apresentam atividade enzimática. Muitos processos celulares dependem de ribozimas, como processamento de</p><p>mRNA e síntese proteica. O ribossomo é um grande complexo ribonucleoproteico (complexo composto por</p><p>RNAs e proteínas) que possui ribozimas ativas em sítios específicos. A existência de ribozimas corrobora a</p><p>hipótese de que o RNA tenha surgido como repositório de informação e como agente catalisador de reações (ver</p><p>Capítulo 1).</p><p>Ação enzimática</p><p>O composto que sofre a ação de uma enzima chama-se substrato. A enzima contém um ou mais centros ativos,</p><p>regiões que podem ser subdivididas em duas:</p><p>uma em que o substrato é acomodado, sítio de ligação; e outra onde</p><p>é processado, sítio catalítico. Em geral esses sítios são distintos, porém algumas enzimas podem apresentar</p><p>regiões com sobreposição de funções. Sítios de ligação orientam espacialmente o substrato por meio de</p><p>interações não covalentes e temporárias, garantindo o posicionamento ideal no sítio catalítico, onde ocorrerá a</p><p>transformação do(s) substratos em produto(s). A forma tridimensional da enzima é importante para a sua</p><p>atividade, pois os centros ativos são regiões cuja conformação tridimensional é complementar à da molécula do</p><p>substrato. Essa complementaridade estrutural é essencial para o encaixe tridimensional preciso entre a enzima e</p><p>seus substratos (Figura 2.9); é por meio desse encaixe que a enzima reconhece e se prende com maior ou menor</p><p>afinidade a seus substratos. É possível afirmar que a maior parte da estrutura da proteína é direcionada para</p><p>manter e modular a atividade do(s) centro(s) ativo(s).</p><p>Figura 2.9 Combinação reversível entre os substratos e o centro ativo da enzima. Demonstra-se</p><p>também a ação enzimática (ATP + glicose → ADP + glicose-6-fosfato). Essa ilustração explica a</p><p>importância da estrutura tridimensional de uma proteína (enzima) para sua atividade biológica. É</p><p>necessário que o substrato se encaixe na enzima para que a reação ocorra.</p><p>A especificidade das enzimas é muito variável. Algumas atuam exclusivamente em um tipo de molécula, não</p><p>atacando sequer seu estereoisômero. Por exemplo, a lactato desidrogenase (LDH) é específica para o L-lactato, e</p><p>a D-aminoácido-oxidase só ataca os D-aminoácidos. Por outro lado, há enzimas que atuam em vários compostos</p><p>com alguma característica estrutural comum, como é o caso das fosfatases, que hidrolisam diversos ésteres do</p><p>ácido fosfórico.</p><p>Para exercerem sua atividade, muitas enzimas necessitam de cofatores, que podem ser um íon metálico, um</p><p>complexo inorgânico ou uma molécula orgânica não proteica. Íons metálicos são cofatores comuns que fazem</p><p>parte de sítios ativos, podendo atuar tanto na ligação do substrato como no centro catalítico. Quando o cofator é</p><p>uma molécula orgânica, recebe o nome de coenzima. As enzimas, sendo proteínas, podem ser desnaturadas e</p><p>inativadas por temperaturas muito elevadas, no entanto, as coenzimas, em geral, são termoestáveis. Coenzimas</p><p>têm função fundamental como transportadoras de grupos orgânicos, como trifosfato de adenosina (ATP/ADP) ou</p><p>acetilcoenzima A (acetil-CoA/CoA), ou como transportadores de elétrons em reações de oxirredução, como</p><p>nicotinamida adenina dinucleotídio (NAD+/NADH) ou fosfato de dinucleotídio de adenina e nicotinamida</p><p>(NADP+/NADPH), desempenhando assim funções indispensáveis no metabolismo celular. Muitas coenzimas são</p><p>derivadas de nucleotídios ou de vitaminas e, dada sua importância bioquímica, sua intensa utilização é associada</p><p>a processos de reciclagem dessas moléculas para a manutenção de seus níveis fisiológicos. A parte ativa de</p><p>muitas coenzimas contém vitaminas do grupo B, como riboflavina, tiamina, ácido pantotênico e nicotinamida,</p><p>sendo importantes em vias metabólicas essenciais como o ciclo de Krebs e a via glicolítica.</p><p>Alguns cofatores estão ligados de modo permanente à enzima, e outros interagem temporariamente, apenas</p><p>durante a ação enzimática. O complexo formado pela enzima com o cofator, independentemente do grau de união</p><p>química entre eles, denomina-se holoenzima. Removendo-se o cofator, resta a parte proteica da enzima, que é</p><p>então inativada e se intitula apoenzima.</p><p>Quando o cofator está fortemente ligado à apoenzima, por exemplo, mediante ligação covalente, ele constitui</p><p>um grupo prostético, e a enzima deve ser considerada uma proteína conjugada. Cofatores não covalentemente</p><p>ligados à enzima denominam-se cossubstratos.</p><p>Nomenclatura</p><p>Muitas enzimas são designadas pelo nome do substrato sobre o qual atuam mais o sufixo “ase”; por exemplo, o</p><p>ácido ribonucleico (substrato) é hidrolisado pela enzima ribonuclease. Outras enzimas – inclusive algumas dentre</p><p>as mais bem estudadas são conhecidas por nomes que não seguem essa regra; são exemplos a pepsina e a</p><p>tripsina, que hidrolisam proteínas.</p><p>Atualmente a nomenclatura de enzimas (entre outras) é regulada pelo Comitê de Nomenclatura da União</p><p>Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (NC-IUBMB), que estabelece uma classificação das enzimas</p><p>em seis categorias principais (Tabela 2.3), cada uma com subdivisões, e normas para a designação mais precisa e</p><p>informativa de cada enzima. A nomenclatura inclui um sistema numérico associado – os “ECs” (do inglês</p><p>Enzyme Commission) –, em que cada enzima é identificada com uma sequência única de quatro números: sendo</p><p>o primeiro o tipo de reação enzimática, seguido por substratos, produtos e mecanismos químicos.</p><p>Por exemplo, pela nomenclatura do Comitê, em geral a enzima hexoquinase que catalisa a reação ATP +</p><p>glicose → glicose-6-fosfato + ADP deve ser denominada “ATP:D-hexose-fosfotransferase” ou “EC 2.7.1.1”.</p><p>Essa é uma transferase que adiciona um grupo fosfato a uma hexose (açúcar). Esta última denominação indica</p><p>mais precisamente a ação da enzima, que é transferir um grupo fosfato do ATP para uma hexose. A nomenclatura</p><p>internacional é pouco usada na prática laboratorial, porque as enzimas recebem designações muito longas, em</p><p>comparação com seus nomes corriqueiros (Tabela 2.4); porém, os métodos analíticos atuais são cada vez mais</p><p>informativos, produzindo cada vez mais dados em ampla escala por técnicas genômicas e proteômicas. Assim, a</p><p>identificação numérica inequívoca torna-se cada vez mais necessária.</p><p>Tabela 2.3 Principais classes de enzimas segundo o Comitê de Nomenclatura da União Internacional</p><p>de Bioquímica e Biologia Molecular (NC-IUBMB). Na classificação completa, cada classe desse</p><p>quadro é subdividida.</p><p>Classe Nome Catalisam Exemplos</p><p>EC 1 Oxirredutases Reações nas quais um</p><p>composto é reduzido e outro</p><p>oxidado</p><p>Desidrogenases, oxidases,</p><p>peroxidases</p><p>EC 2 Transferases Transferência de grupamentos</p><p>químicos de uma molécula</p><p>para outra</p><p>Transaminases,</p><p>transmetilases</p><p>EC 3 Hidrolases Rompimento de moléculas</p><p>com adição de água</p><p>Peptidases, fosfatases,</p><p>esterases</p><p>EC 4 Liases Remoção de um grupo</p><p>químico, originando uma</p><p>dupla ligação no substrato ou</p><p>adição de um grupo a uma</p><p>dupla ligação, que é assim</p><p>desfeita</p><p>Descarboxilases,</p><p>desaminases</p><p>EC 5 Isomerases Rearranjos intramoleculares</p><p>que modificam a estrutura</p><p>tridimensional do substrato</p><p>Racemases, epimerases</p><p>EC 6 Ligases União de duas moléculas, com</p><p>hidrólise de trifosfato de</p><p>adenosina ou outro</p><p>composto rico em energia</p><p>Acetilcoenzima A</p><p>sintetase, carboxilase do</p><p>piruvato</p><p>Tabela 2.4 Exemplo de nomenclatura de enzimas.</p><p>Nome usual EC Nome sistemático Reação</p><p>Lactase EC 3.2.1.108 Lactose galactohidrolase Lactose + H2O = D-</p><p>galactose + D-glicose</p><p>A atividade enzimática pode ser alterada</p><p>A atividade das enzimas, muito sensível a variados agentes químicos e físicos, pode ser alterada de muitas</p><p>maneiras. Entre os fatores que afetam a atividade enzimática, chamam a atenção: temperatura, pH, concentração</p><p>do substrato e ativadores ou inibidores que alteram a velocidade de atuação das enzimas.</p><p>A temperatura tem grande importância prática, uma vez que o frio reduz a atividade enzimática, retardando</p><p>os processos de lise celular e a deterioração de amostras de tecidos, sangue, urina etc., utilizadas em exames de</p><p>laboratório. Em contrapartida, temperaturas altas podem desnaturar as enzimas, afetando a eficiência ou até</p><p>mesmo impossibilitando a catálise.</p><p>O uso de inibidores representa uma maneira de modificar a eficiência de uma enzima que é extensivamente</p><p>estudada, contando com modelos matemáticos e aplicações clínicas e industriais. Em organismos vivos, a</p><p>inibição pode ser parte de um mecanismo de controle de uma via, modulando, assim, toda uma cadeia de</p><p>eventos. Inibidores podem ter ação reversível ou irreversível, e seu mecanismo de inibição pode ser competitivo</p><p>ou não competitivo.</p><p>Inibição competitiva</p><p>A inibição competitiva ocorre quando o inibidor compete</p><p>com o substrato para se ligar ao sítio ativo. Esse</p><p>inibidor é resistente à ação enzimática, mas tem estrutura similar o suficiente com o substrato da enzima para</p><p>interagir com os centros ativos da enzima, ocupando-os no lugar do substrato. O grau de inibição depende da</p><p>proporção entre as concentrações do inibidor e do substrato.</p><p>Inibição não competitiva</p><p>Esse tipo de inibição não é afetado pela concentração do substrato, dependendo exclusivamente da concentração</p><p>do inibidor, que se liga à enzima e diminui sua eficiência, sem interferir na afinidade dessa enzima pelo</p><p>substrato. O caso mais frequente de inibição não competitiva é representado pela combinação reversível de</p><p>metais pesados com os grupos –SH da enzima. Isso altera a forma tridimensional da enzima e impede sua</p><p>atividade. Ocorre também inibição não competitiva quando cofatores da enzima são removidos da solução; por</p><p>exemplo, as enzimas que necessitam de Mg2+ são inibidas pelo etilenodiaminotetracetato de sódio (EDTA). Esse</p><p>composto forma um complexo com cátions divalentes e, desse modo, remove o Mg2+ da solução. A inibição é</p><p>reversível pela adição de cátions Mg2+.</p><p>Complexos enzimáticos promovem reações sequenciais</p><p>A maioria das reações celulares ocorre com a ação de enzimas diferentes, em conjunto e de maneira sequencial,</p><p>de modo que o produto resultante da ação de uma enzima é o substrato para a enzima seguinte, estabelecendo</p><p>intrincados equilíbrios químicos. Esse conjunto de enzimas que trabalham em cooperação é denominado “cadeia</p><p>enzimática”.</p><p>Um sistema muito eficiente e frequente nas células é o representado pelos complexos de enzimas. Nele, todas</p><p>as enzimas da cadeia associam-se para formar um conjunto de moléculas que se mantêm unidas por interações</p><p>químicas fracas (estrutura proteica quaternária). Em leveduras, por exemplo, as enzimas que sintetizam ácidos</p><p>graxos formam uma cadeia que consiste em sete enzimas que se ligam para formar um complexo</p><p>multienzimático. As reações processam-se sequencialmente, e as moléculas intermediárias mantêm-se presas ao</p><p>complexo até a formação da molécula do ácido graxo. Isso torna o sistema mais rápido, uma vez que os</p><p>substratos não precisam deslocar-se muito de uma enzima para outra.</p><p>As cadeias enzimáticas mais bem organizadas e, portanto, mais eficientes são as que estão ligadas a</p><p>membranas. Por exemplo, a cadeia das enzimas respiratórias (transportadoras de elétrons) que estão presas à</p><p>membrana interna das mitocôndrias (ver Capítulo 5).</p><p>A maioria das reações enzimáticas pode ter sua atividade modulada. Isso representa uma importante</p><p>propriedade biológica, porque possibilita às células modificar seletivamente a atividade de enzimas específicas,</p><p>para as adequar às necessidades momentâneas.</p><p>Muitas cadeias enzimáticas são moduladas por autorregulação, sobretudo pelo efeito do produto final da</p><p>cadeia sobre alguma enzima da sequência, anterior à sua formação. Por exemplo, o aminoácido L-treonina é</p><p>transformado em L-isoleucina por uma cadeia de cinco enzimas (Figura 2.10). A primeira enzima dessa cadeia</p><p>(E1) é a L-treonina-desaminase, cuja atividade é diminuída ou suprimida pelo produto final L-isoleucina. Desse</p><p>modo, baixos níveis de L-isoleucina provocam o funcionamento da cadeia em toda a sua intensidade, e o excesso</p><p>desse aminoácidofaz a cadeia diminuir de ritmo ou até parar a produção de mais L-isoleucina. Assim sendo, a</p><p>concentração desse aminoácido na célula permanece nos limites normais. Esse tipo de regulação é muito</p><p>frequente e denomina-se regulação alostérica. A enzima sensível a esse tipo de controle – no exemplo citado, a</p><p>L-treonina-desaminase – intitula-se enzima reguladora, e a substância inibidora – no caso a L-isoleucina – é</p><p>conhecida como efetora ou moduladora.</p><p>Na regulação alostérica, a substância efetora interage com a enzima em um local com função reguladora, que</p><p>é diferente do centro ativo. Este é denominado “centro alostérico”. A interação do efetor com o centro alostérico</p><p>produz uma modificação na conformação tridimensional da enzima, com alteração do centro ativo, cuja atividade</p><p>catalítica é inibida (Figura 2.11).</p><p>Figura 2.10 Regulação (inibição) alostérica. A L-treonina é transformada em L-isoleucina por meio de</p><p>uma cadeia de cinco enzimas. A primeira enzima dessa cadeia é uma proteína alostérica que é</p><p>inibida pela L-isoleucina; assim, o excesso de L-isoleucina bloqueia a síntese desse aminoácido e sua</p><p>falta o estimula.</p><p>Outras vezes, a atividade da enzima é modulada pela interação com outras proteínas ou por modificações</p><p>pós-traducionais, como a adição covalente de grupos fosfato aos aminoácidos serina, treonina ou tirosina</p><p>presentes na enzima, reação denominada “fosforilação” (ver boxe Importância da fosforilação). A fosforilação</p><p>de proteínas desempenha importante papel regulador não apenas em reações metabólicas, mas também em</p><p>muitos outros processos celulares como crescimento, diferenciação celular, desmontagem do envelope nuclear na</p><p>prófase e sua reorganização na telófase.</p><p>Importância da fosforilação</p><p>O grupo fosfato é abundante, compacto e pode apresentar cargas negativas em ambiente</p><p>fisiológico, retendo uma camada de solvatação volumosa; pode ainda formar múltiplas</p><p>ligações covalentes com diferentes funções orgânicas, tornando-o bastante versátil.</p><p>A adição covalente de grupos fosfato a cadeias laterais de aminoácidos é uma modificação</p><p>pós-traducional extremamente frequente em proteínas. Essa ligação é estável e reversível. O</p><p>estabelecimento e a reversão dessa ligação são modulados por maquinaria enzimática</p><p>específica para cada substrato, o que torna o processo de fosforilação ou de desfosforilação</p><p>rápido.</p><p>As enzimas que catalisam a fosforilação são conhecidas como quinases, e as enzimas</p><p>capazes de realizar desfosforilação são as fosfatases. Em geral uma célula eucarionte</p><p>apresenta centenas de enzimas de cada uma dessas categorias. O doador de fosfato mais</p><p>usual é o ATP.</p><p>A adição de um grupo fosfato a uma cadeia peptídica pode promover profundas</p><p>modificações, como: alteração da carga total do peptídio; inserção de um grupo hidrofílico; e</p><p>mudanças conformacionais, uma vez que o fosfato pode participar de pontes de hidrogênio e</p><p>interações iônicas, tanto intramoleculares como intermoleculares. Dessa maneira, a</p><p>fosforilação ou a desfosforilação de uma proteína pode modular sítios catalíticos ou sítios de</p><p>reconhecimento por outras proteínas.</p><p>Além de proteínas, outras biomoléculas, como carboidratos e lipídios, também podem</p><p>sofrer fosforilação.</p><p>Assim, as características anteriormente descritas tornam os eventos de</p><p>fosforilação/desfosforilação uma forma muito útil e de baixo custo energético de modular</p><p>atividades proteicas. Esses eventos, atuando sequencialmente, formam vastas redes de</p><p>regulação que, conjuntamente com outros mecanismos, regem vias metabólicas, de</p><p>transdução de sinal e translocação de proteínas.</p><p>Figura 2.11 Esquema didático de regulação alostérica. A fixação do modulador no centro alostérico</p><p>da proteína (enzima) modifica o centro ativo, impede a fixação do substrato e inibe a ação enzimática.</p><p>Isoenzimas: pequenas diferenças importantes</p><p>Algumas enzimas existem sob formas moleculares ligeiramente distintas nos diversos tecidos, ou na mesma</p><p>célula de determinada espécie. Estas enzimas são chamadas isoenzimas (ou isozimas) e catalisam as mesmas</p><p>reações nos mesmos substratos, mas exibem diferenças na atividade, na regulação, no pH ótimo de ação, na</p><p>mobilidade eletroforética ou em outras características bioquímicas. As diferenças de atividade e na regulação das</p><p>isoenzimas são utilizadas pelas células para modular as reações bioquímicas catalisadas por essas enzimas, de</p><p>acordo com suas necessidades.</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>Isoenzimas apresentam sequências primárias diferentes e são expressas a partir de genes distintos, em</p><p>diferentes localizações do genoma. Em alguns casos, a enzima é um complexo oligomérico, e seus monômeros</p><p>correspondem a isoenzimas com propriedades diferentes, que agrupadas em proporções variáveis resultam em</p><p>enzimas montadas que apresentam</p><p>diferenças de atividade proporcionais aos monômeros presentes.</p><p>Um exemplo bem estudado é a isoenzima lactato desidrogenase (LDH), essencial para a produção de energia</p><p>em organismos anaeróbios e em células aeróbias em hipoxia (condição em que o fornecimento de oxigênio pela</p><p>circulação sanguínea é insuficiente); isso pode acontecer, por exemplo, no músculo estriado esquelético, quando</p><p>se executa atividade muscular muito intensa. Quando as fibras musculares necessitam de mais oxigênio do que a</p><p>circulação sanguínea pode fornecer, elas entram em hipoxia. O piruvato é total ou parcialmente reduzido a</p><p>lactato, em vez de ser oxidado completamente, como acontece quando não existe hipoxia.</p><p>A lactato desidrogenase é constituída por quatro cadeias polipeptídicas (monômeros), de dois tipos</p><p>diferentes: M e H (referentes às formas caracterizadas a partir dos músculos esquelético e cardíaco,</p><p>respectivamente). As variações nas proporções desses dois monômeros produzem cinco lactato desidrogenases</p><p>diferentes, cujas moléculas podem ser assim representadas:</p><p>Primeira:4 cadeias M (M4H0)</p><p>Segunda:3 cadeias M + 1 cadeia H (M3H1)</p><p>Terceira:2 cadeias M + 2 cadeias H (M2H2)</p><p>Quarta:1 cadeia M + 3 cadeias H (M1H3)</p><p>Quinta:4 cadeias H (M0H4).</p><p>Todas essas cinco formas de lactato desidrogenase foram extensivamente estudadas. Elas atuam no mesmo</p><p>substrato (ácido láctico), porém, em velocidades diferentes e se comportam de modo diferente em relação à</p><p>regulação alostérica por piruvato; portanto, do ponto de vista biológico, a principal distinção entre as isoenzimas</p><p>é o grau de atividade de cada uma (Figura 2.12).</p><p>Figura 2.12 A. Reação reversível catalisada pela lactato desidrogenase (LDH). B. Diferentes</p><p>isoenzimas formadas pela mudança na proporção de monômeros de LDH-M em LDH-H. O LDH-M</p><p>tem mais afinidade por piruvato e o LDH-H tem mais afinidade por lactato. DNA: ácido</p><p>desoxirribonucleico; NADH: nicotinamida adenina dinucleotídio. (Adaptada de Valvona et al., 2015.)</p><p>Demonstrou-se que existe um gene que determina a sequência de aminoácidos do monômero M e outro que</p><p>define a do monômero H. Conforme a maior ou menor atividade de cada um desses genes, há elevação da</p><p>produção do mRNA para M ou para H, e os polirribossomos produzirão diferentes quantidades de M e H. Como</p><p>esses monômeros unem-se espontaneamente, ao acaso, para constituir as enzimas, as proporções de M e de H</p><p>dependerão da atividade daqueles genes. Trata-se de um controle gênico, pelo qual, alterando as proporções dos</p><p>monômeros produzidos (cadeias polipeptídicas), os genes influenciarão na estrutura quaternária das proteínas,</p><p>podendo modular a sua atividade enzimática. O perfil de expressão desses genes pode variar ao longo do</p><p>desenvolvimento de um tecido, bem como variar entre tecidos (ver Capítulos 11 e 17).</p><p>Ácidos nucleicos são polímeros de nucleotídios</p><p>Os ácidos nucleicos são biopolímeros em que os monômeros são unidades denominadas “nucleotídios”.</p><p>Cada nucleotídio consiste em uma base nitrogenada ligada covalentemente a uma pentose, um açúcar</p><p>contendo cinco carbonos, que está ligada a um grupo fosfato, formando um éster de ácido fosfórico (Figura</p><p>2.13). As posições de ligação desses grupos na pentose são importantes para definir a estrutura dos ácidos</p><p>nucleicos e sua orientação quando polimerizados. A base nitrogenada está ligada ao carbono 1′, por ligação N-</p><p>glicosídica, e o grupo fosfato está ligado ao carbono 5′ (ver Figura 2.13). A polimerização dos nucleotídios</p><p>ocorre por ataque nucleofílico da hidroxila ligada ao carbono 3′ de um nucleotídio ao fósforo presente no fosfato</p><p>ligado ao carbono 5′ de outro nucleotídio. Logo, as extremidades dos polímeros de ácidos nucleicos são distintas,</p><p>conferindo direcionalidade à molécula.</p><p>Figura 2.13 A. Nucleotídios do ácido ribonucleico (RNA) e do ácido desoxirribonucleico (DNA). As</p><p>bases diferentes (uracila e timina) estão assinaladas. No carbono 29, a desoxirribose contém um</p><p>átomo de oxigênio a menos (observe os retângulos verdes). B. Pequena parte de uma molécula de</p><p>DNA mostrando o arranjo antiparalelo dos polinucleotídios. Entre T e A existem duas pontes de</p><p>hidrogênio e, entre G e C, três. Quando corretamente pareados, ambos os polinucleotídios formam</p><p>uma dupla-fita. No detalhe uma projeção da estrutura da B-DNA, a conformação mais comum na</p><p>natureza.</p><p>Na polimerização dos nucleotídios, os grupos fosfato participam de ligações denominadas “fosfodiésteres”,</p><p>ou “grupos fosfodiéster”, que em condições fisiológicas são ácidos dissociados (Figura 2.14).</p><p>A pentose pode ser uma D-ribose (ou ribose), presente em RNA – ou 2′-desoxi-D-ribose (ou desoxirribose),</p><p>encontrada em DNA. A ausência da hidroxila na posição 2′ da pentose confere estabilidade química maior ao</p><p>DNA.</p><p>As bases nitrogenadas são compostos aromáticos, com estrutura púrica ou pirimídica, essenciais para o</p><p>pareamento de bases entre ácidos nucleicos. As bases púricas mais encontradas nos ácidos nucleicos são a</p><p>adenina e a guanina (ver Figuras 2.13 e 2.15), designadas pelas iniciais A e G, respectivamente. As principais</p><p>bases pirimídicas são a timina, a citosina e a uracila (Figura 2.15), designadas pelas letras T, C e U. No DNA, as</p><p>bases são adenina, guanina, citosina e timina. No RNA, existe uridina em substituição à timina; as outras bases</p><p>são comuns aos dois tipos de ácidos nucleicos (Tabela 2.5).</p><p>Além dos polímeros de nucleotídios que constituem as moléculas dos ácidos nucleicos, as células contêm</p><p>quantidades relativamente grandes de nucleotídios livres, desempenhando, sobretudo, as funções de coenzimas</p><p>(destacando-se ATP e guanosina-trifosfato [GTP]).</p><p>A associação de uma pentose e uma base púrica ou pirimídica produz compostos denominados</p><p>“nucleosídios” (ver Figura 2.15).</p><p>Os ácidos nucleicos codificam a informação genética. Essas informações incluem: (a) elementos codificantes,</p><p>que formarão proteínas após a transcrição e a tradução; e (b) elementos não codificantes que não serão</p><p>transcritos, ou que serão transcritos, mas não serão traduzidos (produzindo RNAs não codificantes). Cada</p><p>elemento apresenta regiões de controle com diferentes mecanismos de ação. Os elementos não codificantes são</p><p>fundamentais, pois podem exercer função de regulação da expressão gênica (ver Capítulo 11). A regulação dos</p><p>diversos processos biológicos mediante essas informações genéticas ainda está sendo intensamente estudada,</p><p>sendo frequentes novas descobertas nessa área.</p><p>O DNA é o repositório da informação genética e a transmite para as</p><p>células-filhas</p><p>O DNA armazena e transmite informação genética. É encontrado principalmente nos cromossomos nucleares e,</p><p>em pequenas quantidades, nos cromossomos das mitocôndrias e dos cloroplastos das plantas. Nos cromossomos</p><p>das células eucariontes, o DNA está associado a proteínas básicas, principalmente histonas. O complexo de</p><p>DNA associado a proteínas nucleares denomina-se cromatina. Proteínas nucleares associadas ao DNA evitam</p><p>quebras e emaranhamentos da cromatina e formam estruturas que o mantêm mais compacto. Além disso,</p><p>participam da regulação da transcrição e da replicação (ver Capítulos 10 e 11), bem como na segregação de</p><p>cromossomos às células-filhas na divisão celular (ver Capítulo 10).</p><p>A molécula de DNA consiste em duas cadeias de nucleotídios dispostas em hélice em torno de um eixo. A</p><p>orientação dessas hélices é dirigida no sentido da esquerda para a direita (sentido horário ou dextrogiro) (ver</p><p>Figura 2.13). A direção das ligações fosfodiésteres 3′ e 5′ de uma cadeia é inversa em relação à da outra, como</p><p>mostra a Figura 2.13. Diz-se que essas cadeias são antiparalelas. Em função disso, em cada extremidade da</p><p>molécula uma das cadeias polinucleotídicas termina em 3´ e a outra em 5′. Conforme explicado anteriormente, o</p><p>DNA apresenta uma estabilidade química maior que o RNA, tornando-o uma molécula mais adequada para a</p><p>função de armazenar informações e transmiti-las para descendentes.</p><p>Figura 2.14 Polinucleotídio do ácido desoxirribonucleico (DNA).</p><p>A conformação mais comum de DNA encontrada na natureza</p><p>é a B-DNA. Nessa conformação, a cadeia dá</p><p>uma volta a cada 10 pares de bases aproximadamente, apresenta diâmetro de 2 nm e contém dois sulcos de</p><p>tamanhos diferentes, originados da forma helicoidal da molécula (ver Figura 2.13). Esses sulcos são utilizados</p><p>por complexos proteicos para interações com o DNA, de modo dependente ou independente de sequências</p><p>específicas.</p><p>As bases púricas e pirimídicas de cada cadeia polinucleotídica situam-se no interior da dupla-hélice, em</p><p>planos paralelos entre si e perpendiculares ao seu eixo, como se fossem degraus de uma escada. Em cada plano</p><p>ou “degrau da escada”, a base de uma cadeia forma par com a base complementar na cadeia oposta. Em razão</p><p>das dimensões das moléculas das bases, o pareamento ocorre apenas entre a timina e a adenina ou entre a</p><p>guanina e a citosina das cadeias complementares, portanto, considerando-se os dois polinucleotídios que</p><p>constituem a molécula de DNA, as bases estão sempre pareadas entre T-A ou G-C, o que explica a existência, no</p><p>DNA, de número igual de moléculas de T e A, e de G e C.</p><p>Figura 2.15 Componentes e estrutura dos ácidos ribonucleico e desoxirribonucleico (RNA e DNA). O</p><p>nucleosídio está contido no quadrado tracejado em vermelho. O nucleotídio tem um grupo fosfato e</p><p>está delimitado em azul.</p><p>Tabela 2.5 Características dos principais tipos de ácidos nucleicos.</p><p>DNA tRNA mRNA rRNA</p><p>Componentes Ácido fosfórico,</p><p>desoxirribose,</p><p>adenina,</p><p>guanina,</p><p>citosina e</p><p>timina</p><p>Ácido fosfórico,</p><p>ribose, adenina,</p><p>guanina,</p><p>citosina, uracila,</p><p>timina, ácido</p><p>pseudouridílico,</p><p>metilcitosina,</p><p>dimetilguanina</p><p>Ácido fosfórico,</p><p>ribose,</p><p>adenina,</p><p>guanina,</p><p>citosina e</p><p>uracila</p><p>Ácido fosfórico,</p><p>ribose, adenina,</p><p>guanina, citosina</p><p>e uracila</p><p>Funções Conter e</p><p>transmitir a</p><p>informação</p><p>genítica para</p><p>as células-</p><p>filhas</p><p>Transporta os</p><p>aminoácidos,</p><p>unindo seu</p><p>anticódon ao</p><p>códon do</p><p>mRNA;</p><p>determina a</p><p>posição dos</p><p>aminoácidos</p><p>nas proteínas</p><p>Através da</p><p>sequência de</p><p>sua base,</p><p>determina a</p><p>posição dos</p><p>aminoácidos</p><p>nas proteínas</p><p>Combina-se com o</p><p>mRNA para</p><p>formar os</p><p>polirribossomos</p><p>Localização Núcleo das</p><p>células</p><p>eucariontes,</p><p>nucleoide das</p><p>procariontes;</p><p>mitocôndrias e</p><p>cloroplastos;</p><p>alguns vírus</p><p>Principalmente</p><p>no citoplasma;</p><p>menor</p><p>quantidade no</p><p>núcleo</p><p>Principalmente</p><p>no citoplasma;</p><p>menor</p><p>quantidade no</p><p>núcleo</p><p>Principalmente no</p><p>citoplasma;</p><p>menor</p><p>quantidade no</p><p>núcleo</p><p>Tamanho da</p><p>molécula</p><p>Usualmente</p><p>muito grande,</p><p>dependendo</p><p>do organismo</p><p>25 a 30 kDa Depende do</p><p>tamanho da</p><p>proteína que</p><p>codifica;</p><p>variável entre</p><p>5 × 104 a 5 ×</p><p>1016 Da</p><p>5 a 28 S</p><p>Forma Dupla-hélice</p><p>Filamento</p><p>simples, em</p><p>certos vírus</p><p>“Folha de trevo” Filamento</p><p>simples</p><p>Ribossomo;</p><p>tamanho: células</p><p>eucariontes 2,3</p><p>nm (80 S), células</p><p>procariontes 1,8</p><p>nm (70 S)</p><p>DNA: ácido desoxirribonucleico; mRNA: ácido ribonucleico mensageiro; tRNA: ácido ribonucleico de transferência; rRNA:</p><p>ácido ribonucleico ribossomal.</p><p>Na dupla-hélice, as bases unem-se por meio de pontes de hidrogênio (ver Figura 2.13), principais</p><p>responsáveis pela estabilidade da hélice. Quando as pontes de hidrogênio são rompidas – por exemplo, pelo</p><p>aquecimento do DNA em solução –, as duas moléculas de polinucleotídios da hélice sofrem desnaturação,</p><p>separando-se; quando a temperatura retorna a níveis fisiológicos, eles se unem novamente.</p><p>A desnaturação pelo rompimento das pontes de hidrogênio pode ser completa ou parcial, ocorrendo antes nas</p><p>ligações AT, que têm duas pontes de hidrogênio. As ligações CG são mais resistentes, pois têm três pontes de</p><p>hidrogênio (ver Figura 2.13).</p><p>A desnaturação parcial, em experimentos denominados “cinética de desnaturação”, possibilita a identificação</p><p>das zonas ricas em AT e em CG, sendo esses últimos segmentos mais resistentes à desnaturação. Este tipo de</p><p>análise permite estimar a proporção de sequências repetitivas em um genoma, entre outras características de sua</p><p>organização. Atualmente, técnicas que utilizam sondas fluorescentes sensíveis ao pareamento de bases são</p><p>capazes de identificar diferenças de uma base em experimentos de desnaturação de DNA denominados “curvas</p><p>de desnaturação de alta resolução” (HRM, do inglês high resolution melt analysis).</p><p>Além das pontes de hidrogênio, a dupla-hélice conta com interações hidrofóbicas para estabilizar sua</p><p>estrutura, uma vez que as bases nitrogenadas (aromáticas e hidrofóbicas) situam-se no interior da hélice, e os</p><p>resíduos de desoxirribose (hidrofílicos) e de ácido fosfórico (ionizado e hidrofílico) localizam-se na periferia, em</p><p>contato com o meio aquoso. Os grupos fosfóricos, ionizados negativamente, promovem a interação do DNA com</p><p>proteínas básicas, isto é, carregadas positivamente ou com outras moléculas eletricamente positivas.</p><p>Transcrição: o DNA como molde para a síntese de RNA</p><p>Todo RNA é sintetizado no núcleo a partir de um “molde” de DNA presente em região específica nos</p><p>cromossomos e representa a transcrição de um segmento de uma das cadeias da hélice de DNA. O processo</p><p>biológico dessa síntese denomina-se transcrição e é realizado por um complexo enzimático conhecido como</p><p>RNA polimerase. Em eucariontes, diferentes complexos de RNA polimerase realizam a transcrição de tipos</p><p>específicos de genes em diferentes tipos de RNAs. Por exemplo, genes que codificam proteínas e RNAs</p><p>reguladores serão transcritos pelo complexo RNA polimerase II (ver Capítulo 11).</p><p>A conformação mais comum do DNA é a hélice de dupla-fita, já a molécula de RNA, por sua vez, é mais</p><p>comum em um filamento único, mas também pode formar hélices de filamentos duplos complementares em</p><p>diversas situações.</p><p>Apesar de o RNA não ser amplamente utilizado como meio de armazenamento genético (exceto em vírus),</p><p>esta macromolécula é fundamental para diferentes processos celulares. Dos pontos de vista funcional e estrutural,</p><p>distinguem-se três variedades principais de RNA, e outras cuja função ainda não estão completamente</p><p>compreendidas (conforme descrito na Tabela 2.6).</p><p>Esses últimos são classes de RNAs descobertas nas últimas décadas e têm revolucionado nosso entendimento</p><p>sobre regulação gênica e outros processos biológicos. Em geral esses tipos de RNA não são traduzidos em</p><p>proteínas e podem exercer funções reguladoras, estruturais e até enzimáticas. Atualmente, são foco de pesquisas</p><p>e descobertas frequentes sobre funções desconhecidas e seu envolvimento em processos biológicos.</p><p>RNA mensageiro</p><p>A massa molecular dos mRNA é da ordem de centenas e até milhares de dáltons. Nas células procariontes, as</p><p>moléculas de mRNA podem ser ainda maiores, pois podem conter a transcrição de vários genes que codificam</p><p>diferentes proteínas, sendo chamadas “RNAs mensageiros policistrônicos”.</p><p>Em eucariotos os mRNA podem sofrer modificações após a transcrição. Cada molécula de mRNA madura</p><p>tem um prolongamento na sua extremidade 3′, denominado “cauda de poli-A”, que pode conter dezenas ou</p><p>centenas de bases adenina. Ele é adicionado assim que a molécula de mRNA é transcrita, ainda no interior do</p><p>núcleo celular, por uma enzima que não requer molde (template) de DNA, portanto esse segmento do mRNA não</p><p>está codificado no DNA. O comprimento da cauda de poli-A modula a meia-vida do mRNA e é regulado por</p><p>exonucleases citoplasmáticas, sendo seu encurtamento diretamente relacionado com uma meia-vida menor. Na</p><p>outra extremidade do mRNA (extremidade 5′), um pequeno capuz (cap) de nucleotídio é adicionado por outras</p><p>enzimas. Esse capuz consiste em uma 7-metilguanosina ligada ao primeiro nucleotídio do mRNA por uma</p><p>ligação 5′-5′ trifosfato. Dentre suas funções constam a exportação nuclear do mRNA e a proteção contra a ação</p><p>de exonucleases (ver Capítulo 11).</p><p>Tabela 2.6 Principais variedades de RNAs transcritos em eucariotos.</p><p>Tipos de RNAs transcritos em</p><p>eucariotos Abundância Funções e características</p><p>RNA mensageiro ou mRNA ≈ 3% Editado após transcrição; poliadenilado em</p><p>3′; capuz em 5′; comprimento varia de</p><p>centenas até milhares de bases; função na</p><p>tradução</p><p>RNA de transferência ou</p><p>tRNA</p><p>≈ 15% Editado e processado no núcleo; 75 a 95</p><p>bases; nucleotídios incomuns; função na</p><p>tradução</p><p>RNA ribossomal ou rRNA ≈ 80% Processados no núcleo; componentes</p><p>de</p><p>ribossomos; bastante conservados entre</p><p>espécies; funções estruturais e catalíticas</p><p>Pequenos RNAs nucleares ou</p><p>snRNAs (do inglês small</p><p>< 1% Ricos em uracila; ≈ 150 bases; função no</p><p>splicing</p><p>nuclear RNA)</p><p>Pequenos RNAs nucleolares</p><p>ou snoRNAs (do inglês small</p><p>nucleolar RNAs)</p><p>< 1% Ricos em uracila; 60 a 300 bases; função em</p><p>modificações químicas em outros RNAs</p><p>(metilação ou pseudouridilação)</p><p>MicroRNA ou miRNA < 1% 21 a 23 bases; processados e editados no</p><p>núcleo; regulação da expressão gênica</p><p>RNAs longos não</p><p>codificantes ou lncRNAs (do</p><p>inglês long noncoding RNAs)</p><p>< 1% Comprimento variável (> 200 bases);</p><p>processados e editados no núcleo, função</p><p>em diferentes processos (regulação de</p><p>transcrição, splicing, regulação de tradução,</p><p>silenciamento gênico, inativação do</p><p>cromossomo X, imprinting e replicação)</p><p>Além dessas modificações em suas extremidades, os mRNA de eucariotos passam por um complexo</p><p>processamento desde sua transcrição até o momento em que são exportados do núcleo para o citoplasma,</p><p>envolvendo variadas alterações em suas sequências (ver Capítulo 11).</p><p>RNA de transferência</p><p>Dos três tipos de RNA, o tRNA é o que tem moléculas menores, constituídas de 75 a 90 nucleotídios, e de massa</p><p>molecular entre 23 e 30 kDa. Sua função é transferir os aminoácidos para as posições corretas nas cadeias</p><p>polipeptídicas em formação nos complexos de ribossomos e mRNA (polirribossomos). Para isso, o tRNA</p><p>combina-se a aminoácidos e reconhece sequências específicas de três bases no mRNA. Essas sequências, típicas</p><p>para cada aminoácido, são denominadas códons. A sequência de três bases na molécula do tRNA que reconhece</p><p>um códon chama-se anticódon (Figura 2.16). Cada tipo de tRNA só pode estar ligado a um aminoácido</p><p>específico, determinado pelo seu anticódon. Como o código genético é degenerado, existem múltiplos tRNA para</p><p>cada aminoácido (múltiplos códons; ver Capítulo 12).</p><p>Figura 2.16 A. Representação da estrutura do ácido ribonucleico de transferência (tRNA) para o</p><p>aminoácido tirosina e suas interações intramoleculares. Além das bases habituais, esse RNA de</p><p>transferência (tRNA) contém as seguintes bases: mG = N-2-metilguanosina; dhU = N-6-diidrouridina;</p><p>omG = 2′-O-metilguanosina; dmG = 2′-dimetilguanosina; dmA = N-6-dimetiladenosina; 5 mC = 5-</p><p>metilcitosina. A letra grega psi (Ψ) representa o ácido pseudouridílico. B. Estrutura terciária de um</p><p>tRNA. C. Pareamento de códons e anticódons.</p><p>A molécula do tRNA é um filamento único com uma extremidade 3′ terminando sempre pela sequência de</p><p>nucleotídios CCA, no qual será ligado covalentemente um aminoácido específico.</p><p>Todos os tRNA apresentam segmentos das moléculas formados por uma dupla-hélice por interação</p><p>intramolecular, mediada por pontes de hidrogênio. A representação plana, esquemática, da estrutura secundária</p><p>da molécula de tRNA (ver Figura 2.16) tem o aspecto de uma folha de trevo, a qual mostra o anticódon em um</p><p>de seus lados (chamado “alças”), no entanto sua estrutura terciária lembra uma letra L, devido às interações</p><p>intramoleculares.</p><p>O tRNA apresenta características que o diferenciam dos outros tipos de RNAs, facilitando a sua</p><p>identificação. Além das bases adenina, guanina, citosina e uracila, comumente encontradas no RNA, o tRNA</p><p>contém outras bases que não aparecem nos outros tipos de ácido ribonucleico (ver Tabela 2.5). Entre essas bases</p><p>típicas do tRNA, estão, por exemplo, a hipoxantina e a metilcitosina. O tRNA tem ainda ácido ribotimidílico, que</p><p>é um nucleotídio constituído por ácido fosfórico, ribose e timina, base geralmente encontrada no DNA. Além</p><p>disso, o tRNA apresenta em sua molécula o ácido pseudouridílico, que difere do ácido uridílico comum por</p><p>apresentar a ribose ligada ao carbono 5 da uracila, e não ao nitrogênio 3, como é habitual (Figura 2.17).</p><p>As regiões do tRNA que contêm as bases não habituais talvez sejam importantes para determinar o formato</p><p>da molécula, pois nessas regiões não se formam pontes de hidrogênio entre as bases (ver Figura 2.16 B).</p><p>RNA ribossomal</p><p>O RNA ribossomal (rRNA) é um componente fundamental da síntese proteica. Ele combina-se a proteínas</p><p>específicas para formar os ribossomos, sendo elementos essenciais na conversão da informação contida no</p><p>mRNA em polipeptídios (tradução) (ver Capítulo 12). O rRNA é muito mais abundante que os outros dois tipos</p><p>de RNA, constituindo 80% do RNA celular. Quando múltiplas unidades de ribossomos se associam a filamentos</p><p>de mRNA, formam os polirribossomos (Figura 2.18), nos quais ocorre simultaneamente a síntese de múltiplas</p><p>cópias da proteína codificada pelo mRNA.</p><p>Existem nas células dois tipos de ribossomos que se distinguem por seus coeficientes de sedimentação</p><p>determinados por ultracentrifugação. O coeficiente de sedimentação relaciona a velocidade de sedimentação com</p><p>a aceleração a que a amostra é submetida na ultracentrífuga, sendo proporcional à massa e à densidade das</p><p>partículas (partículas mais pesadas sedimentam mais rapidamente). Esses coeficientes são expressos em unidades</p><p>S (Svedberg). Os ribossomos das células procariontes têm coeficiente de sedimentação de 70S e são menores do</p><p>que os ribossomos das células eucariontes, cujo coeficiente de sedimentação é de 80S. Ambos os tipos de</p><p>ribossomos são formados por duas subunidades, uma maior e outra menor, com características funcionais e</p><p>estruturais diferentes.</p><p>A subunidade maior dos ribossomos das células eucariontes contém três tipos de rRNA, com sedimentações</p><p>de 28S, 5,8S e 5S, e a dos ribossomos das procariontes, dois tipos de rRNA: um de 23S e outro de 5S. A</p><p>subunidade menor apresenta apenas um tipo de rRNA: 18S nas células eucariontes e 16S nas procariontes.</p><p>O sequenciamento dos RNAs 16S de procariontes é bastante utilizado para a identificação e estudos de</p><p>filogenia desses organismos (ver Capítulo 1).</p><p>As mitocôndrias e os cloroplastos também têm ribossomos próprios, porém, eles são similares aos das células</p><p>procariontes. Essa semelhança apoia a interpretação de que essas duas organelas se originaram de bactérias que</p><p>se tornaram simbiontes das células eucariontes (ver Capítulo 5).</p><p>Cerca de 50 variedades de proteínas foram identificadas nos ribossomos e constituem aproximadamente a</p><p>metade da massa desses corpúsculos.</p><p>Figura 2.17 Dois nucleotídios encontrados no ácido ribonucleico de transferência (tRNA): no ácido</p><p>pseudouridílico, a ribose liga-se ao carbono 5 da uridina, e não ao nitrogênio 3, como ocorre no ácido</p><p>uridílico. O ácido ribotimidílico contém timina, uma base que geralmente é encontrada no ácido</p><p>desoxirribonucleico (DNA).</p><p>Figura 2.18 Combinação do ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) com ribossomos para formar</p><p>polirribossomos. Nesse arranjo podem ser sintetizadas múltiplas proteínas com um mesmo mRNA.</p><p>(Adaptada de Alberts et al., 2002.)</p><p>Em geral, os genes de rRNA estão organizados em múltiplas cópias concatenadas (unidades de repetição) em</p><p>regiões denominadas “rDNA”, as quais podem estar localizadas em diferentes cromossomos. Alças</p><p>cromossômicas contendo rDNA, entre outros genes, são intituladas regiões organizadoras de nucléolo. Durante a</p><p>interfase, observa-se a formação do nucléolo em torno dessas regiões de DNA, sendo composto de diferentes</p><p>complexos proteicos estruturais, enzimáticos, e diferentes tipos de RNA agregados. A transcrição e o</p><p>processamento do rRNA, bem como a complexa montagem dos ribossomos e o processamento de RNAs não</p><p>codificantes e tRNA, ocorrem nessa região (ver Capítulos 9 e 11).</p><p>Em outras palavras, o nucléolo é um grande complexo de macromoléculas envolvido funcionalmente com a</p><p>síntese proteica. Seu tamanho é proporcional à atividade sintética celular.</p><p>RNAs não codificantes</p><p>Uma fração significativa de RNAs de eucariotos não é traduzida em proteínas. Essas classes de RNAs ainda não</p><p>foram completamente compreendidas. Suas funções ainda são descobertas em diversificados processos celulares,</p><p>atuando como catalisadores, reguladores, suportes, e até mesmo como moldes para síntese de pequenos</p><p>segmentos de ácidos nucleicos repetitivos (como em telômeros, por exemplo).</p><p>Os miRNAs são um exemplo de RNA com função reguladora. Assim como outros RNAs, os miRNAs são</p><p>transcritos e processados no núcleo, porém no citoplasma eles atuam na regulação da tradução pela degradação</p><p>catalítica e específica de mRNA.</p><p>Cada miRNA é capaz de regular a expressão de um gene ou de uma família de genes, dependendo de sua</p><p>homologia com os alvos. Uma grande porção dos genes de eucariotos são suscetíveis a esse tipo de regulação,</p><p>evidenciando sua importância em diferentes processos biológicos.</p><p>Outra classe de RNAs não codificantes que ainda é pouco descrita, mas já demonstra importância biológica,</p><p>são os lncRNAs (RNAs longos não codificantes). Definidos apenas pelo comprimento maior do que 200</p><p>nucleotídios, esse critério não relaciona os lncRNAs às suas funções na célula.</p><p>Os lncRNAs já caracterizados demonstram relevância em diferenciados processos celulares, como regulação</p><p>de transcrição, splicing, regulação de tradução, silenciamento gênico, inativação do cromossomo X, imprinting e</p><p>replicação. Alguns demonstraram um papel estrutural em complexos proteicos ou moduladores de atividade</p><p>enzimática. Muitas de suas atividades mostraram-se dependentes de pareamento de bases, oferecendo, assim,</p><p>especificidade da sequência do lncRNA ao alvo que deverá interagir, de modo semelhante ao descrito para</p><p>miRNA.</p><p>Assim, os RNAs não codificantes com função reguladora promovem uma gama surpreendente de ajustes, em</p><p>que, muitas vezes, poucos RNAs não codificantes atuam em múltiplos genes-alvo formando redes redundantes</p><p>de regulação. Novas pesquisas reiteram cada vez mais a importância dessa via de regulação em processos</p><p>relacionados com a biologia do desenvolvimento e a evolução.</p><p>RNAs catalíticos</p><p>RNA é uma molécula capaz de assumir conformações estáveis com complexas estruturas secundárias e</p><p>terciárias, criando centros catalíticos com seus grupos hidroxilas e aminas, e frequentemente criando nichos que</p><p>estabilizam íons divalentes, como Mg2+. Algumas ribozimas podem catalisar a clivagem de ligações</p><p>fosfodiésteres por um mecanismo de substituição nucleofílica (SN2) de modo semelhante aos seus equivalentes</p><p>enzimáticos proteicos.</p><p>A atividade catalítica do RNA foi descoberta ao se estudar a síntese dos RNA de Tetrahymena, um</p><p>protozoário ciliado. Descobriu-se que esses RNAs são inicialmente moléculas muito grandes das quais</p><p>determinados segmentos são removidos e as partes restantes são soldadas (splicing), formando-se, assim, a</p><p>molécula final do mRNA. Todo o processo se realiza, como foi comprovado in vitro, sem a participação de</p><p>enzimas. O segmento de RNA que será removido (íntron) catalisa sua própria remoção e a união das</p><p>extremidades da molécula partida. Esse segmento de RNA catalisa a polimerização de polinucleotídios pequenos</p><p>em polinucleotídios com mais de 30 nucleotídios, tendo sido chamado “ribozima”.</p><p>Outros RNAs com atividade catalítica foram descobertos logo depois, como, por exemplo, os tRNA, que,</p><p>quase sempre, também são sintetizados em tamanho maior. Nesse caso, observou-se que a clivagem para</p><p>produzir a molécula de tRNA final, de tamanho menor, é catalisada por um complexo RNA–proteína</p><p>(ribonuclease P); mas a especificidade e a atividade enzimática desse complexo dependem mais do RNA do que</p><p>da proteína. Separando-se o complexo RNA–proteína em suas duas partes, somente o RNA tem atividade</p><p>catalítica, embora o complexo inteiro seja mais ativo, portanto, nesse caso o RNA é essencial para a atividade</p><p>enzimática e a proteína exerce um papel auxiliar, secundário.</p><p>O rRNA é outro exemplo de ação catalítica de RNA. O ribossomo também é uma ribozima que forma as</p><p>ligações peptídicas entre aminoácidos durante a síntese proteica (atividade peptidiltransferase). O rRNA é um</p><p>componente importante do sítio catalítico ribossomal.</p><p>A descoberta de que o RNA pode ter atividade enzimática teve grande repercussão nas hipóteses quanto à</p><p>origem da vida na Terra (ver Capítulo 1). É possível que a molécula inicial das futuras células tenha sido um</p><p>RNA capaz de autorreplicação. Esse RNA primordial teria servido de molde (template) para o DNA, iniciando,</p><p>em seguida, a síntese dirigida das proteínas.</p><p>Lipídios</p><p>Os lipídios compreendem diferentes substâncias, com variedade estrutural, que apresentam como característica</p><p>em comum a solubilidade em solventes orgânicos não polares – como éter, clorofórmio e benzeno – e pouca ou</p><p>nenhuma solubilidade em água.</p><p>De acordo com suas funções principais, os lipídios celulares podem ser divididos em duas categorias: lipídios</p><p>de reserva nutritiva e lipídios estruturais.</p><p>Vale salientar a existência de lipídios com atividades fisiológicas, como as vitaminas A, E e K. Bem como</p><p>lipídios com funções reguladoras (endócrinas), como os hormônios esteroides, entre os quais os da suprarrenal,</p><p>de ovário e testículo, e o 1,25-diidroxicolecalciferol (substância ativa formada no organismo dos mamíferos a</p><p>partir da “vitamina” D). Todavia, como exercem funções especializadas, e não são constituintes gerais das</p><p>células, não serão estudados neste capítulo.</p><p>Lipídios de reserva nutritiva</p><p>As reservas nutritivas de natureza lipídica consistem principalmente de triacilgliceróis (triglicerídios). São</p><p>compostos formados de ácidos graxos combinados ao glicerol por esterificação (Figura 2.19). Os triglicerídios</p><p>são sintetizados pela adição sequencial de um ácido graxo. Assim, monoglicerídios contêm apenas um ácido</p><p>graxo esterificado; diglicerídios contêm dois e triglicerídios, três ácidos graxos. Os glicerídios, com</p><p>predominância de triglicerídios, estão presentes no citoplasma de quase todas as células; porém, há células</p><p>especializadas para o armazenamento desses compostos ricos em energia, denominadas “células adiposas”.</p><p>Os ácidos graxos de um triglicerídio podem ser idênticos, mas geralmente variam no tamanho de suas</p><p>moléculas e no grau de saturação. Diz-se saturado o ácido graxo que não apresenta ligações duplas entre seus</p><p>átomos de carbono.</p><p>Figura 2.19 Glicerol e ácidos graxos podem ser esterificados para formar triglicerídios (um triéster).</p><p>Na ilustração, vê-se um exemplo de triglicerídio saturado. Os triglicerídios são neutros e bastante</p><p>hidrofóbicos, formando gotículas em determinados tipos celulares.</p><p>Embora representem principalmente reserva energética, os triacilgliceróis desempenham outras funções. Por</p><p>exemplo, como são bons isolantes térmicos, oferecem proteção contra o frio para animais que vivem em</p><p>ambientes cuja temperatura é baixa, como ursos, pinguins e outros. Nesses animais, existe uma camada de</p><p>células adiposas sob a pele que funciona como eficiente isolante térmico.</p><p>Os triglicerídios que contêm muitos ácidos graxos saturados são sólidos ou semissólidos na temperatura</p><p>ambiente, sendo denominados “gorduras”. As gorduras predominam no corpo dos animais. Nas plantas, a</p><p>maioria dos triglicerídios é líquida na temperatura ambiente, sendo conhecidos como óleos vegetais. A</p><p>abundância de ácidos graxos insaturados, cujas moléculas têm formato irregular, impede a ordenação das</p><p>moléculas para constituir o estado sólido. Por isso, os óleos vegetais têm ponto de fusão mais baixo. Esses óleos</p><p>são metabolizados mais facilmente pelo organismo dos animais.</p><p>Lipídios estruturais</p><p>Fazem parte da bicamada de membranas celulares três tipos de lipídios: fosfolipídios (fosfoglicerídios e</p><p>esfingolipídios), glicolipídios e colesterol. Todas essas biomoléculas são anfipáticas, isto é, apresentam uma</p><p>região polar ou hidrofílica, solúvel em meio aquoso, e uma região apolar ou hidrofóbica, insolúvel em água</p><p>(Figura 2.20).</p><p>Figura 2.20 Há três tipos de lipídios nas membranas celulares; todos apresentam uma cabeça</p><p>hidrofílica ou polar (em azul) e uma cauda hidrofóbica ou apolar (em vermelho). A. Estrutura básica</p><p>de um fosfolipídio que apresenta uma cabeça polar ligada a duas caudas alifáticas. Note que a</p><p>presença de uma dupla ligação entre carbonos da cauda apolar (insaturação) forma uma pequena</p><p>curvatura nessa cadeia. B. Galactocerebrosídio (um tipo de glicolipídio), os glicolipídios de maneira</p><p>geral apresentam</p><p>duas caudas apolares (em vermelho), um grupo hidroxila e carboidratos (nesse</p><p>caso a galactose) como regiões polares (em azul). C. Colesterol (esterol) apresenta um grupo</p><p>hidroxila (polar) ligado a uma estrutura em anéis (rígida e apolar) e uma pequena cauda de</p><p>hidrocarboneto apolar (em vermelho).</p><p>Fosfolipídios</p><p>Fosfoglicerídios</p><p>Os fosfolipídios são os macroelementos mais abundantes das membranas e apresentam uma região hidrofílica</p><p>ligada a duas cadeias hidrofóbicas de hidrocarbonetos (chamadas “caudas”) (ver Capítulo 4). Os fosfoglicerídios</p><p>são o resultado da esterificação de glicerol-3-fosfato com um par de ácidos graxos (ver Figura 2.20). Os ácidos</p><p>graxos podem apresentar cadeias de 14 a 24 átomos de carbono e diferentes insaturações (ligações duplas) entre</p><p>carbonos adjacentes da cadeia.</p><p>O fosfoglicerídio mais simples é o ácido fosfatídico, constituído apenas por uma molécula de glicerol, uma</p><p>de ácido fosfórico e duas de ácidos graxos. O ácido fosfatídico existe em pequena quantidade nas membranas</p><p>celulares. Os fosfoglicerídios mais encontrados nessas membranas são fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina,</p><p>fosfatidilserina e fosfatidilinositol.</p><p>A presença das duas cadeias de hidrocarbonetos nos fosfolipídios formadores das membranas celulares é a</p><p>característica mais importante para a existência da bicamada lipídica. Em solução aquosa, moléculas lipídicas</p><p>anfipáticas agregam-se espontaneamente de modo que as regiões hidrofóbicas fiquem protegidas da interação</p><p>com moléculas de água e sua região hidrofílica fique exposta. Lipídios que apresentam somente uma cadeia de</p><p>hidrocarboneto formam uma estrutura esférica chamada “micela”, em que as cadeias ficam no interior, protegidas</p><p>das moléculas de água (Figura 2.21). Porém, as duas cadeias de hidrocarbonetos dos lipídios são grandes demais</p><p>para caber em uma micela, por isso a bicamada lipídica é o arranjo energeticamente mais favorável nesse caso</p><p>(ver Figura 2.21). Se a bicamada não se fechasse em si mesma, as bordas hidrofóbicas ficariam expostas às</p><p>moléculas de água (ver Figura 2.21). Esse fechamento é o que faz com que a membrana seja capaz de fechar</p><p>pequenas rupturas que possam acontecer na membrana (capacidade autosselante). Grandes rupturas na</p><p>membrana são fechadas com auxílio da inserção de vesículas intracelulares (ver Capítulo 4).</p><p>Figura 2.21 Arranjo espontâneo de moléculas lipídicas em solução aquosa. A. Estrutura da molécula</p><p>lipídica com uma cauda de hidrocarboneto (formato de cunha) que em meio aquoso forma uma</p><p>micela. B. Esquema da estrutura de fosfolipídios que apresenta duas caudas de hidrocarbonetos</p><p>(formato cilíndrico) que em meio aquoso formam uma bicamada lipídica. C. Fechamento espontâneo</p><p>da bicamada lipídica formando uma esfera que delimita o compartimento interno e externo. Essa é a</p><p>conformação que melhor previne a interação de moléculas de água com a região central hidrofóbica</p><p>(faixa branca entre as camadas em azul) da bicamada lipídica. (Adaptada de Alberts B et al., 2017</p><p>[Figura 11-12]; e de Nelson e Cox. s/d. Disponível em:</p><p>http://aulanni.lecture.ub.ac.id/files/2012/01/15616949-Lehninger-Principles-of-Biochemistry-1-</p><p>copy.pdf.)</p><p>Esfingolipídios</p><p>http://aulanni.lecture.ub.ac.id/files/2012/01/15616949-Lehninger-Principles-of-Biochemistry-1-copy.pdf</p><p>A principal característica estrutural dos esfingolipídios é a presença da longa cadeia de esfingosina (um</p><p>aminoálcool com cadeia de 18 carbonos) ao lado de uma cadeia de ácido graxo, que se prende à esfingosina por</p><p>uma ligação éster (ver Figura 2.20). Tal como os fosfoglicerídios, os esfingolipídios têm uma extremidade polar e</p><p>duas caudas apolares.</p><p>Um exemplo de esfingolipídio é a esfingomielina, muito abundante nas bainhas de mielina do tecido nervoso.</p><p>A bainha de mielina funciona como isolante elétrico de prolongamentos das células nervosas, sendo formada por</p><p>arranjos concêntricos da membrana plasmática de células especializadas.</p><p>A esfingomielina é constituída por uma molécula de colina, uma de ácido fosfórico, uma de esfingosina e</p><p>uma de ácido graxo (ver Figura 2.20).</p><p>Estrutura modular de fosfolipídios</p><p>Os fosfolipídios apresentam quatro componentes: dois ácidos graxos (que podem ter ligações</p><p>duplas entre carbonos adjacentes – as insaturações); e uma “plataforma” na qual essas</p><p>cadeias se ligam e um fosfato que une essa plataforma a um grupo polar (ver Figura 2.20).</p><p>Essa plataforma pode ser o glicerol (por isso chamados “glicerofosfolipídios” ou</p><p>“fosfoglicerídios”) ou a esfingosina (os esfingofosfolipídios). O mais simples dos</p><p>glicerofosfolipídios não tem nenhum grupo polar ligado ao fosfato e é denomiando</p><p>“fosfatídio”. Os grupos polares mais comuns ligados a um fosfatídio são a colina, a</p><p>etanolamina, a serina e o inositol, que produzem a fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina,</p><p>fosfatidilserina e fosfatidilinositol, respectivamente. Além de essenciais nas membranas, os</p><p>dois últimos são componentes importantes na sinalização celular (ver Capítulo 6). Entre os</p><p>esfingofosfolipídios, o mais abundante é a esfingomielina.</p><p>Glicolipídios</p><p>Outro constituinte anfipático importante das membranas celulares são os glicolipídios, designação genérica para</p><p>todos os lipídios que contêm carboidratos com ou sem o grupo fosfato. Alguns como o galactocerebrosídio (ver</p><p>Figura 2.20) não apresentam carga, outros podem conter resíduos de ácido siálico (um tipo de carboidrato), o que</p><p>confere caráter negativo à sua região hidrofóbica. Os glicolipídios mais abundantes em células animais são os</p><p>glicoesfingolipídios, que são componentes de muitos receptores das superfícies celulares.</p><p>Os cerebrosídios (ver Figura 2.20) são glicoesfingolipídios, pois suas moléculas contêm esfingosina e</p><p>glicídios. Os cerebrosídios são abundantes nas membranas das células do tecido nervoso, sobretudo nas bainhas</p><p>de mielina.</p><p>Colesterol</p><p>O colesterol é um esterol localizado na membrana plasmática das células animais, ocorrendo, porém, em</p><p>quantidade muito menor nas membranas das mitocôndrias e do retículo endoplasmático (Figura 2.22). Ele</p><p>modula a fluidez das membranas (ver Capítulo 4).</p><p>Figura 2.22 Molécula de colesterol na bicamada lipídica. A hidroxila do colesterol (na parte azul)</p><p>interage com a cabeça hidrofílica dos fosfolipídios de membrana, enquanto a região em anel rígida e</p><p>sua cauda hidrofóbica se inserem entre cadeias apolares de dois fosfolipídios, preenchendo esse</p><p>espaço e diminuindo a mobilidade dessas moléculas, regulando, assim, a permeabilidade e fluidez da</p><p>membrana fosfolipídica.</p><p>As células dos vegetais não contêm colesterol, que é então substituído por outros esteróis, denominados</p><p>coletivamente “fitoesteróis”.</p><p>As longas cadeias hidrofóbicas nos lipídios são de grande importância biológica, pois são elas que</p><p>possibilitam a interação hidrofóbica responsável pela associação de lipídios para formar a bicamada lipídica das</p><p>membranas celulares. A fixação das proteínas integrais das membranas se dá pela interação das porções</p><p>hidrofóbicas das moléculas dessas proteínas com os lipídios das membranas. A interação hidrofóbica também é</p><p>importante no transporte de lipídios no plasma. Por exemplo, os esteroides circulam presos a uma região</p><p>hidrofóbica da superfície da molécula de albumina, que é solúvel em água (ver Capítulo 4).</p><p>Os polissacarídios formam reservas nutritivas e unem-se a proteínas</p><p>para formar glicoproteínas (função enzimática e estrutural) e</p><p>proteoglicanas (função estrutural)</p><p>Os polissacarídios são polímeros de monossacarídios. Há polissacarídios com moléculas lineares e outros com</p><p>moléculas ramificadas. A molécula de alguns polissacarídios é constituída pela repetição de um único tipo de</p><p>monossacarídio; são os polissacarídios simples ou homopolímeros. Por exemplo, o amido e o glicogênio são</p><p>polímeros simples de D-glicose e não contêm outro tipo de molécula monomérica. Os polissacarídios complexos</p><p>(heteropolímeros), constituídos por mais de um tipo de monossacarídio, são menos frequentes nas células, porém</p><p>alguns são biologicamente muito importantes.</p><p>Os polissacarídios associados à superfície externa</p><p>da membrana celular desempenham papel estrutural e na</p><p>sinalização celular, muitas vezes fazendo parte de receptores de membrana (ver Capítulo 4).</p><p>Polissacarídios de reserva</p><p>Os polissacarídios de reserva são o glicogênio, nas células animais, e o amido, nas células das plantas; ambos</p><p>são polímeros da D-glicose.</p><p>Glicogênio</p><p>O glicogênio é armazenado no citoplasma das células animais sob a forma de grânulos, com diâmetro de 15 a 30</p><p>nm, geralmente dispostos em aglomerados (ver Figura 1.7). Os grânulos de glicogênio, além do polissacarídio,</p><p>contêm proteínas, como as enzimas responsáveis pela síntese e despolimerização do glicogênio.</p><p>A D-glicose recebida em excesso pela célula é adicionada, por processo enzimático, às extremidades da</p><p>molécula de glicogênio. A liberação de D-glicose para uso em processos metabólicos celulares também ocorre</p><p>por atividade enzimática. A degradação enzimática do glicogênio é denominada “glicogenólise”. O fígado tem</p><p>um papel fisiológico importante na manutenção dos níveis de glicose no plasma sanguíneo, por meio da</p><p>glicogenólise dos depósitos de glicogênio dos hepatócitos.</p><p>A molécula de glicogênio tem dimensões variáveis e é muito ramificada em todas as direções do espaço</p><p>(Figura 2.23).</p><p>Amido</p><p>Ao contrário da célula animal, que armazena glicogênio, a célula vegetal tem amido como reserva energética. O</p><p>amido é composto de dois tipos de moléculas: a amilose, um polímero linear, e a amilopectina, um polímero</p><p>ramificado, ambos constituídos por unidades de glicose.</p><p>Polissacarídios estruturais e sinalização celular</p><p>Além dos polissacarídios de reserva nutritiva (glicogênio e amido), as células sintetizam outros polissacarídios</p><p>que fazem parte da superfície celular, onde participam do reconhecimento entre as células para constituir os</p><p>tecidos, da constituição dos receptores celulares e das ligações estruturais entre o citoplasma e a matriz</p><p>extracelular (ver Capítulo 8).</p><p>Combinados com proteínas, os polissacarídios estruturais fazem parte do glicocálice das células animais, da</p><p>parede das células bacterianas e da parede das células das plantas (ver Capítulo 4). A maioria dos polissacarídios</p><p>estruturais e de sinalização são heteropolímeros. Eles constituem as glicosaminoglicanas, que se ligam a</p><p>proteínas para formar as proteoglicanas, e a porção glicídica das glicoproteínas. Os polissacarídios têm funções</p><p>energéticas, estruturais e de comunicação (glicocálice, hormônios glicoproteicos).</p><p>Figura 2.23 Exemplos de polímeros de glicose que atuam como reserva de energia: (A) glicogênio,</p><p>altamente ramificado e solúvel; (B) amilopectina, com ramificações menos frequentes que o</p><p>glicogênio; (C) amilose, polímero linear.</p><p>Bibliografia</p><p>Alberts B, Bray D, Hopkin K, Johnson A, Lewis J, Raff M et al. Fundamentos da Biologia Celular. 4a ed. São Paulo: Artmed; 2017.</p><p>Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York: Garland Science; 2002.</p><p>Armstrong FB. Biochemistry. 3rd ed. Oxford Univ Press; 1989.</p><p>Biochemical Nomenclature Committees. International Union of Pure and Applied Chemistry and International Union of Biochemistry</p><p>and Molecular Biology. Available from: https://iubmb.qmul.ac.uk/nomenclature/.</p><p>Bolsover SR. Cell Biology. A Short Course. 2nd ed. Wiley-Liss; 2003.</p><p>Doolittle RF. Proteins. Sci Amer. 1985;253(4):88.</p><p>Gilbert W. The RNA world. Nature. 1986;319:618.</p><p>Guerrier-Takada C, Altman S. Catalytic activity of an RNA molecule prepared by transcription in vitro. Science. 1985;223:285.</p><p>Hubbard RE, Haider MK. Hydrogen bonds in proteins: role and strength. 2010. Disponível em:</p><p>https://doi.org/10.1002/9780470015902.a0003011.pub2.</p><p>Hunter T. Why nature chose phosphate to modify proteins. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2012;367(1602):2513-6.</p><p>International Union of Pure and Applied Chemistry. Grandezas, unidades e símbolos em físico-química. Tradução atualizada para o</p><p>Português (nas variantes brasileira e portuguesa) da 3 edição em inglês. Available from:</p><p>http://www.sbq.org.br/livroverde/anexos/LivroVerde_IUPAC_SBQ-SPQ_2018.pdf</p><p>Lehninger AL. Biochemistry. The molecular basis of cell structure and function. 2nd ed. Worth Pub; 1982.</p><p>Lehninger AL, Nelson DL, Cox MM. Principles of Biochemistry. 2nd ed. Worth Pub; 1993.</p><p>Mildvan AS. Mechanism of enzyme action. Ann Rev Biochem. 1974;43:357.</p><p>Murray RK, Granner DK, Mayes PA et al.: Harper’s Biochemistry. 24th ed. Appleton & Lange; 1996.</p><p>Nelson DL, Cox MM. Lehninger Principles of Biochemistry. 4th ed. Disponível em:</p><p>http://aulanni.lecture.ub.ac.id/files/2012/01/15616949-Lehninger-Principles-of-Biochemistry-1-copy.pdf.</p><p>Perutz M. Protein Structure: New Approaches to Disease and Therapy. Freeman; 1992.</p><p>Schweigger HG. International Cell Biology. Springer-Verlag; 1981.</p><p>Sigman DS, Mooser G. Chemical studies of enzyme active sites. Ann Rev Biochem. 1975;44:889.</p><p>Stryer L. Bioquímica. 4. ed. Guanabara Koogan; 1996.</p><p>https://iubmb.qmul.ac.uk/nomenclature/</p><p>https://doi.org/10.1002/9780470015902.a0003011.pub2</p><p>http://www.sbq.org.br/livroverde/anexos/LivroVerde_IUPAC_SBQ-SPQ_2018.pdf</p><p>http://aulanni.lecture.ub.ac.id/files/2012/01/15616949-Lehninger-Principles-of-Biochemistry-1-copy.pdf</p><p>Tanford C. The hydrophobic effect and the organization of living matter. Science. 1978;200:1012.</p><p>Voet D, Voet JG. Biochemistry. 4th ed. John Wiley; 2011.</p><p>Valvona CJ, Fillmore HL, Nunn PB et al. The regulation and function of lactate dehydrogenase a: therapeutic potential in brain tumor.</p><p>Brain Pathol. 2016;26(1):3-17.</p><p>Zaug AJ, Cech TR. The intervening sequence RNA of tetrahymena is an enzyme. Science. 1986;231:470.</p><p>Introdução</p><p>Técnicas de microscopia</p><p>Preparo de amostras para microscopias ópticas</p><p>Microscopia eletrônica</p><p>Microscópio eletrônico de varredura</p><p>Microscopia de fluorescência</p><p>Imunocitoquímica e sondas moleculares</p><p>Outras sondas</p><p>Corantes e ensaios in vivo</p><p>Genes repórteres</p><p>Ensaios bioquímicos</p><p>Ensaios moleculares</p><p>Edição gênica como ferramenta de estudos</p><p>Bibliografia</p><p>Introdução</p><p>A compreensão de uma célula não é uma tarefa simples. É necessário o conhecimento sobre sua morfologia,</p><p>sobre seus componentes moleculares, sobre como esses componentes relacionam-se durante seu funcionamento e</p><p>sobre como todos esses atributos operam ao longo de seu ciclo de vida.</p><p>As técnicas que possibilitam investigar as propriedades celulares não surgiram simultaneamente, e ainda há</p><p>muito o que se desenvolver. De fato, os conhecimentos sobre as células progridem paralelamente ao</p><p>aperfeiçoamento dos métodos de investigação, tornando a Biologia Celular e Molecular campo de pesquisa cada</p><p>vez mais ativo nos dias atuais.</p><p>Os estudos que inicialmente se limitavam à observação de amostras nos séculos XVII ao XIX, quase sempre</p><p>estáticas devido ao preparo, evoluíram para pesquisas bioquímicas e microanálises durante o século XX, e</p><p>atualmente a tecnologia proporciona manipulações genéticas e fisiológicas, bem como análises in vivo, muitas</p><p>vezes em ampla escala, produzindo grandes quantidades de dados que exigem métodos computacionais para sua</p><p>análise. É impossível descrever, mesmo de modo resumido, todas as técnicas utilizadas nos variados estudos</p><p>sobre as células. Cada pesquisador desenvolve abordagens diversificadas, de acordo com o problema a ser</p><p>resolvido. Neste capítulo, apenas como exemplos, serão estudadas algumas técnicas que têm contribuído de</p><p>modo significativo para o progresso da biologia celular e molecular. Para se manter a dimensão do livro razoável,</p><p>muitas técnicas não serão descritas; porém, algumas serão citadas e vinculadas, sempre que possível, a uma</p><p>referência bibliográfica ou digital para pesquisa posterior.</p><p>Técnicas de microscopia</p><p>Inicialmente, o microscópio óptico, também denominado “microscópio de luz”, possibilitou o descobrimento das</p><p>células e a elaboração da teoria de que todos os seres vivos são constituídos por elas.</p><p>Posteriormente, foram desenvolvidas técnicas citoquímicas para a identificação e localização de diferentes</p><p>moléculas constituintes das células. Com o advento dos microscópios eletrônicos,</p><p>livro ser retirada do</p><p>mercado.</p><p>Caso haja alguma mudança no sistema ou dificuldade de acesso, entre em contato conosco</p><p>(gendigital@grupogen.com.br).</p><p>http://www.grupogen.com.br/</p><p>mailto:gendigital@grupogen.com.br</p><p>Capítulo 5</p><p>Capítulo 1</p><p>Capítulo 2</p><p>Capítulo 3</p><p>Capítulo 4</p><p>Capítulo 6</p><p>Capítulo 7</p><p>Capítulo 8</p><p>Capítulo 9</p><p>Capítulo 10</p><p>Capítulo 11</p><p>Capítulo 12</p><p>Capítulo 13</p><p>Capítulo 14</p><p>Sumário</p><p>Introdução: Visão Panorâmica sobre Estrutura, Funções e Evolução das Células</p><p>PATRICIA PEREIRA COLTRI</p><p>Biomoléculas e Constituição Celular</p><p>FÁBIO SIVIERO</p><p>Métodos de Pesquisa em Biologia Celular e Molecular</p><p>FÁBIO SIVIERO</p><p>Membranas Celulares</p><p>FERNANDA ORTIS</p><p>Mitocôndrias: Centro do Metabolismo Energético e Participantes em Diversos</p><p>Processos Celulares</p><p>ALICIA KOWALTOWSKI</p><p>Comunicação e Sinalização Celular</p><p>CAROLINA BELTRAME DEL DEBBIO</p><p>Citoesqueleto</p><p>MARINILCE FAGUNDES DOS SANTOS</p><p>Adesão Celular</p><p>MARINILCE FAGUNDES DOS SANTOS CHAO YUN IRENE YAN NATHALIE CELLA</p><p>Núcleo e Replicação Celular</p><p>NATHALIE CELLA</p><p>Ciclo Celular: Mitose e Meiose</p><p>CAROLINA BELTRAME DEL DEBBIO</p><p>Expressão Gênica</p><p>PATRICIA PEREIRA COLTRI</p><p>Síntese de Proteínas: Tradução</p><p>PATRICIA PEREIRA COLTRI</p><p>Endereçamento Enovelamento e Degradação Proteica</p><p>FÁBIO SIVIERO</p><p>Retículo Endoplasmático e Complexo de Golgi</p><p>Capítulo 15</p><p>Capítulo 16</p><p>Capítulo 17</p><p>FERNANDA ORTIS</p><p>Transporte Através de Membranas Celulares e Tráfego Intracelular</p><p>FERNANDA ORTIS</p><p>Morte Celular</p><p>CAROLINA BELTRAME DEL DEBBIO</p><p>Diferenciação Celular</p><p>CHAO YUN IRENE YAN</p><p>Glossário</p><p>Padrões celulares e grandes grupos de seres vivos</p><p>Evolução das células</p><p>Células eucariontes compartimentalizadas</p><p>Citoplasma</p><p>Núcleo</p><p>Retículo endoplasmático</p><p>Complexo de Golgi</p><p>Lisossomos</p><p>Endossomos</p><p>Mitocôndrias</p><p>Peroxissomos</p><p>Bibliografia</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>Atualmente, os seres vivos são classificados em cinco grandes grupos ou reinos. Grande parte da diversificação</p><p>desses grupos deveu-se ao aumento da complexidade intracelular, incluindo maior sofisticação de processos de</p><p>expressão gênica e modificação de proteínas. Na primeira e segunda partes deste capítulo, serão abordadas a</p><p>classificação dos seres vivos e também as estruturas celulares e suas origens; a compartimentalização intracelular</p><p>marcante nos eucariotos será apresentada na última parte.</p><p>Padrões celulares e grandes grupos de seres vivos</p><p>O sistema mais antigo de classificação, criado por Lineu (1707-1778), dividia os seres vivos em dois reinos: o</p><p>animal e o vegetal. No primeiro estavam incluídos os organismos heterotróficos – aqueles que dependem de</p><p>outros seres vivos para se alimentarem; no segundo, estavam os organismos autotróficos fotossintetizantes, ou</p><p>seja, aqueles capazes de produzir seu próprio alimento a partir da energia solar, como as plantas. Além destes, as</p><p>bactérias, os mixomicetos e os fungos também integravam o reino vegetal. Essa classificação tem sido</p><p>modificada à medida que novas informações sobre a relação evolutiva entre os organismos são descobertas.</p><p>Em 1969, Robert Whittaker (1920-1980) propôs classificar os seres vivos em cinco reinos (Figura 1.1),</p><p>conforme a seguir:</p><p>Monera: formado pelas bactérias, que são os únicos seres procariontes (as cianofíceas, ou “algas azuis”,</p><p>também são bactérias)</p><p>Protista: compreende organismos eucariontes primariamente unicelulares de vida livre ou unicelulares</p><p>coloniais (protozoários e fitoflagelados)</p><p>Fungi: compreende todos os fungos</p><p>Plantae: inclui as algas clorofíceas e os vegetais superiores</p><p>Animalia: inclui todos os animais, isto é, os seres que, durante o desenvolvimento embrionário, passam pelo</p><p>estágio de gástrula.</p><p>O conceito atual de protista não é o mesmo proposto por Haeckel (1834-1919) no passado. Atualmente, os</p><p>protistas incluem os protozoários e os fitoflagelados; estes últimos são organismos com flagelos e autotróficos,</p><p>capazes de obter energia a partir de compostos inorgânicos (p. ex., luz, água e amônia). Essa classificação</p><p>também separou os fungos do grupo dos vegetais, diferentemente do que havia sido proposto por Lineu.</p><p>Algumas características específicas distinguem os fungos de animais e vegetais, como:</p><p>Ausência de clorofila ou qualquer pigmento fotossintetizante</p><p>Ausência de parede de celulose e a presença de uma parede composta por quitina (característica dos animais)</p><p>Não armazenamento de amido (reserva nutritiva dos vegetais) mas, sim, de glicogênio (reserva nutritiva dos</p><p>animais).</p><p>Mais recentemente, o uso de marcadores moleculares possibilitou o estudo mais detalhado das relações</p><p>evolutivas entre os organismos, ou filogênese. A elucidação da evolução molecular parece ser a melhor maneira</p><p>de esclarecer as origens das células contemporâneas e de desvendar as características das células primordiais que</p><p>apareceram há cerca de 3,5 bilhões de anos. Esses estudos utilizam diferentes moléculas para análise, como a</p><p>sequência de aminoácidos nas proteínas e de nucleotídios nos ácidos nucleicos, ou avaliam enzimas importantes</p><p>para o metabolismo dos organismos. A comparação da sequência de nucleotídios no RNA ribossomal (rRNA) é</p><p>uma poderosa ferramenta no estudo da filogênese. Todas as células apresentam ribossomos, formados por rRNAs</p><p>e proteínas. A sequência de nucleotídios dos rRNAs é bem conservada, ou seja, permaneceu relativamente</p><p>constante em diferentes organismos, por essa razão, servem como “relógios moleculares”. Em outras palavras, as</p><p>diferenças entre sequências de rRNAs de duas espécies são usadas para estimar o tempo transcorrido desde que</p><p>elas divergiram do seu ancestral comum, isso é, a sua distância evolutiva (Figura 1.2). Assim, duas espécies que</p><p>apresentam, proporcionalmente, mais nucleotídios diferentes em suas sequências de rRNA divergiram há mais</p><p>tempo, estando mais distantes do seu ancestral comum. Já duas outras espécies que diferem em poucos</p><p>nucleotídios têm um ancestral comum mais recente. Essas análises serviram para desenhar novas árvores</p><p>filogenéticas e possibilitaram a proposição de novas classificações para os organismos.</p><p>Com base na variação entre sequências de rRNA de diferentes organismos, o biólogo Carl Woese (1928-</p><p>2012) propôs uma nova classificação dos seres vivos em três grandes domínios (ver Figura 1.1):</p><p>Eubactéria, que inclui as bactérias</p><p>•</p><p>•</p><p>Archaea, ou arqueobactéria, organismos procariontes com características específicas e diferentes de</p><p>eubactérias e de eucariontes</p><p>Eucarya ou eucarionte, que inclui todos os eucariotos, organismos com núcleo celular delimitado pelo</p><p>envelope nuclear.</p><p>Nessa classificação, todas as bactérias estão no domínio eubactéria. O domínio archaea compreende os</p><p>procariontes metanógenos (que produzem o gás metano como produto de sua metabolização) e os que vivem em</p><p>condições extremas de temperatura, salinidade, acidez ou alcalinidade. O domínio eucarya ou eucarionte engloba</p><p>todos os seres constituídos por células eucariontes, com sistema interno de membranas e compartimentalizações.</p><p>Organismos de cada um desses domínios têm características moleculares marcantes. A maior diversidade é</p><p>observada entre os microrganismos dos domínios eubactéria e archaea. A composição de bases (nucleotídios) nos</p><p>rRNAs de archaea mostra algumas semelhanças com os seres do domínio eucarya, e outras com o domínio</p><p>eubactéria. Archaea e eubactéria são procariontes e não apresentam envelope nuclear, de modo que os processos</p><p>de transcrição e tradução ocorrem quase simultaneamente. Além de diferenças no rRNA, as células do domínio</p><p>archaea têm paredes celulares sem proteoglicanos, compostos encontrados nas paredes das eubactérias. Por outro</p><p>lado, apresentam genoma circular e muitos genes agrupados em operons, tal como observado em eubactérias.</p><p>Figura 1.1 Classificação dos seres vivos. A. Whitakker propôs uma classificação com cinco reinos em</p><p>1969. O reino Monera, cujos organismos apresentam células procariontes, é composto por bactérias e</p><p>algas cianofíceas. Nos demais reinos, os organismos são formados por células eucariontes. O reino</p><p>Protista é composto de formas unicelulares ou unicelulares coloniais. O reino Fungi compreende os</p><p>fungos.</p><p>que apresentam grande poder</p><p>de resolução, foram observados pormenores da estrutura celular que não poderiam sequer ser imaginados pelos</p><p>estudos realizados com os microscópios ópticos.</p><p>Quase simultaneamente ao uso dos microscópios eletrônicos, foram aperfeiçoados métodos para a separação</p><p>de organelas celulares e para o estudo in vitro de suas moléculas e respectivas funções. A análise de organelas</p><p>isoladas em grande quantidade, a cultura de células, análises in vivo, a possibilidade de manipular o genoma por</p><p>meio de adição ou supressão de genes e o aparecimento de numerosas técnicas de uso comum aos diferentes</p><p>ramos da pesquisa biológica possibilitaram o surgimento da Biologia Celular e Molecular, que é o estudo</p><p>integrado das células, por meio de todo o vasto arsenal técnico disponível.</p><p>Microscópio óptico ou microscópio de luz</p><p>O microscópio óptico (Figura 3.1) foi a principal ferramenta de estudo da biologia celular e ainda permanece</p><p>como um dos principais recursos de pesquisa nesse campo. O microscópio composto como se conhece</p><p>atualmente foi desenvolvido no século XVII e sua evolução produziu instrumentos precisos e com grande poder</p><p>de resolução e contraste para pesquisadores de todo o mundo.</p><p>O microscópio composto possui uma parte mecânica, que serve de suporte, e uma parte óptica, constituída</p><p>por três sistemas de lentes: o condensador, a objetiva e a ocular.</p><p>A finalidade do condensador é projetar raios de luz sobre as células que estão sendo examinadas no</p><p>microscópio. Após atravessá-las, esse feixe luminoso, em formato de cone, penetra na objetiva, a qual projeta</p><p>uma imagem aumentada, no plano focal da ocular, que, novamente, a amplia. Por fim, a imagem fornecida pela</p><p>ocular pode ser percebida pela retina (Figura 3.2) como uma imagem situada a 25 cm da lente ocular, ou então</p><p>pode ser projetada sobre uma tela, um filme fotográfico ou sensor digital. A ampliação total oferecida por um</p><p>microscópio é igual ao aumento da objetiva multiplicado pelo aumento da ocular.</p><p>A partir da microscopia óptica simples, em que a luz atravessa a amostra (iluminação de campo claro) e é</p><p>absorvida por esta, variadas técnicas foram desenvolvidas para aprimorar o contraste ou detectar características</p><p>da amostra. Variações na iluminação incidente ou na detecção da luz proveniente da amostra podem revelar</p><p>detalhes, possibilitar análises quantitativas e até mesmo a observação de células vivas. Na microscopia de luz</p><p>polarizada, o uso de filtros de polarização evidencia a direção do arranjo de elementos birrefringentes (descritos</p><p>mais adiante) na amostra, como arranjos de tubulina ou elementos contráteis de células musculares. Outro</p><p>exemplo é a microscopia de contraste de fase, que por detecção de variações de índices de refração ou espessura</p><p>de partes da amostra, pode revelar estruturas celulares sem corantes em células vivas.</p><p>Figura 3.1 Microscópio óptico moderno, binocular, com iluminação embutida. (Fotografia cedida pelo</p><p>fabricante, Carl Zeiss.)</p><p>Figura 3.2 Esquema do microscópio óptico mostrando o trajeto dos raios luminosos: (1) base do</p><p>microscópio, (2) condensador, (3) lente objetiva, (4) cristalino do globo ocular, em que (A) sistema de</p><p>iluminação, (B) platina, (C) tubo binocular e (D) globo ocular do observador. (Ilustração cedida pela</p><p>empresa Carl Zeiss, imagens de cortes histológicos cedidas pelo Departamento de Biologia Celular e</p><p>do Desenvolvimento – ICB-USP.)</p><p>Resolução óptica</p><p>Chama-se poder de resolução de um sistema óptico a sua capacidade de separar detalhes. Na</p><p>prática, o poder de resolução é expresso pelo limite de resolução (LR), que é a menor</p><p>distância que deve existir entre dois pontos para que eles apareçam individualizados. Por</p><p>exemplo: duas partículas separadas por 0,3 μm mostram-se pormenorizadas quando</p><p>examinadas em um sistema óptico com limite resolutivo de 0,2 μm, porém, aparecem como</p><p>uma partícula única quando o limite resolutivo é de 0,5 μm (Figuras 3.3 e 3.4).</p><p>O que determina, pois, a riqueza de detalhes da imagem fornecida por um sistema óptico</p><p>é o seu LR, e não o seu poder de aumentar o tamanho dos objetos. O aumento do tamanho</p><p>apenas tem valor prático se acompanhado de um incremento concomitante do poder</p><p>resolutivo. O LR depende essencialmente da lente objetiva; a ocular não pode acrescentar</p><p>detalhes à imagem, sua função é apenas aumentar o tamanho da imagem, que é projetada</p><p>em seu plano de foco pela objetiva.</p><p>O LR depende, sobretudo, da abertura numérica (AN) da objetiva (ver Figura 3.4) e do</p><p>comprimento de onda da luz utilizada e é fornecido pela seguinte fórmula:</p><p>Em que k é uma constante estimada por alguns em 0,61 e, por outros, em 0,5, e λ é o</p><p>comprimento de onda da luz empregada. Na prática, o objeto é iluminado por luz branca,</p><p>constituída por diferentes comprimentos de onda.</p><p>A análise dessa fórmula mostra que o LR é diretamente proporcional ao comprimento de</p><p>onda da luz utilizada e inversamente proporcional à AN da objetiva.</p><p>Figura 3.3 As principais unidades de medida utilizadas em Biologia Celular são o micrômetro (μm) e o</p><p>nanômetro (nm). A unidade ångström (Å) deve ser substituída pelo nanômetro. A ilustração mostra a</p><p>equivalência entre essas unidades, comparando-as também com o milímetro (mm). As setas indicam</p><p>os limites (aproximados) de resolução do olho humano, do microscópio óptico e do microscópio</p><p>eletrônico.</p><p>Figura 3.4 Esquema do feixe luminoso que penetra em uma objetiva mostrando o semiângulo de</p><p>abertura, que faz parte do cálculo da abertura numérica.</p><p>Microscópio de polarização</p><p>O emprego de um feixe luminoso polarizado possibilita estudar determinados aspectos da organização molecular</p><p>dos constituintes celulares. Ao atravessar a célula, essa projeção luminosa pode transpassar estruturas cristalinas</p><p>ou constituídas por moléculas alongadas e paralelas, que interagem com a luz, alterando inclusive sua</p><p>polarização. Essas estruturas são denominadas anisotrópicas e birrefringentes, pois apresentam índices de</p><p>refração diferentes, conforme a incidência da luz. As estruturas celulares que não apresentam tal organização não</p><p>modificam o plano de polarização da luz e são intituladas isotrópicas.</p><p>O microscópio de polarização é semelhante ao microscópio óptico comum, acrescido de dois prismas ou dois</p><p>filtros polarizadores. Um desses elementos é inserido no condensador e funciona como polarizador; o outro é</p><p>colocado na lente ocular, e nomeado de analisador. A função do polarizador é iluminar a célula com feixe de luz</p><p>polarizada. O analisador verifica o efeito das estruturas celulares sobre o feixe polarizado.</p><p>Quando o polarizador e o analisador estão com seus planos de polarização perpendiculares (cruzados),</p><p>somente as estruturas birrefringentes ou anisotrópicas podem ser vistas. Isso ocorre porque elas modificam o</p><p>feixe polarizado, que pode atravessar o analisador e formar uma imagem. Esse tipo de microscopia pode indicar</p><p>a direção de arranjos de proteínas, como elementos do citoesqueleto.</p><p>Microscópio de contraste de fase</p><p>Esse tipo de microscópio é empregado, em especial, para o estudo de células vivas. É de grande utilidade para a</p><p>observação de células cultivadas, cujos crescimento e divisão mitótica podem ser facilmente seguidos sem o</p><p>emprego de corantes.</p><p>Esse microscópio é dotado de um sistema óptico que transforma as diferenças de fase dos raios luminosos em</p><p>diferenças de intensidade. Assim, essas diferenças de fase, para as quais o olho não é sensível, tornam-se</p><p>visíveis, pois são transformadas em diferenças de intensidade luminosa, facilmente perceptíveis (Figura 3.5). O</p><p>microscópio de contraste de fase pode ser utilizado para que as estruturas celulares apareçam escuras (fase</p><p>positiva) ou claras (fase negativa) – (ver Figura 3.5 C e D).</p><p>A velocidade da luz ao atravessar um corpo e o índice de refração deste dependem da quantidade de matéria</p><p>presente, isto é, da densidade do corpo. Quanto maior for a densidade, menor será a velocidade da luz no interior</p><p>desse corpo. As diferentes estruturas celulares apresentam quantidades variadas de matéria e causam</p><p>atrasos</p><p>diferentes na luz que as atravessa. Isso provoca diferenças de fase na luz emergente, que, por interferência, são</p><p>transformadas em variações de amplitude, ocasionando alterações visíveis de intensidade luminosa.</p><p>Uma variação dessa microscopia é o microscópio idealizado por Normaski. Neste, o microscópio de contraste</p><p>de fase utiliza luz polarizada. Assim como no microscópio de fase comum, as estruturas celulares tornam-se</p><p>visíveis em razão da interferência dos raios luminosos emergentes (ver Figura 3.5 B).</p><p>Microscópio confocal de varredura a laser</p><p>Células isoladas e cortes de tecidos têm espessura maior do que o plano de foco do microscópio óptico. Na</p><p>prática, as lâminas são examinadas usando-se o artifício de variar o plano de focalização por meio do botão</p><p>micrométrico do microscópio, o que modifica a distância entre as células e a lente objetiva. Com a</p><p>movimentação do botão micrométrico, um plano da célula entra em foco, e os outros planos saem de foco;</p><p>todavia, esse procedimento tem o inconveniente de oferecer uma imagem do plano focalizado que perde nitidez</p><p>pela interferência dos raios luminosos que perpassam os planos fora de foco. Na realidade, forma-se uma</p><p>imagem nítida do plano focalizado e, simultaneamente, a ela está sobreposta à imagem “borrada” dos outros</p><p>planos da célula. O microscópio confocal (Figura 3.6) soluciona esse inconveniente do microscópio óptico</p><p>comum.</p><p>No microscópio confocal, a iluminação ocorre por um delgado feixe de laser, que varre o corte iluminando-</p><p>o apenas, ponto por ponto, em um determinado plano da célula, realizando um verdadeiro “corte óptico”. A</p><p>imagem é formada exclusivamente pelas estruturas que estão no plano da varredura, sem que os componentes</p><p>celulares situados em outros planos interfiram na formação da imagem (ver Figura 3.6). Não somente a imagem</p><p>é muito nítida, como também a célula pode ser virtualmente “fatiada” durante a microscopia, e as “fatias” obtidas</p><p>podem ser utilizadas de várias maneiras. Geralmente, as células são marcadas com um composto fluorescente; a</p><p>luz emitida é processada em um computador, e a imagem adquirida é exibida em um monitor de vídeo. As</p><p>imagens obtidas pela varredura de múltiplos planos podem ser armazenadas e processadas digitalmente para</p><p>reproduzir reconstruções tridimensionais ou para evidenciar possíveis interações entre estruturas ou componentes</p><p>moleculares (colocalizações), de acordo com a finalidade do estudo. As imagens digitalizadas podem ser</p><p>arquivadas para estudos posteriores ou produção de animações.</p><p>Figura 3.5 Comparação entre a microscopia comum e três tipos de microscopia de interferência</p><p>(contraste de fase) na observação de uma célula epitelial sem coloração. A. Microscópio comum. B.</p><p>Microscopia interferencial segundo Normasky. C. Microscópio de contraste de fase, com fase positiva.</p><p>D. Microscopia de contraste de fase, com fase negativa. (Fotomicrografias gentilmente cedidas pelo</p><p>Professor Raul Machado.)</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>Figura 3.6 Esquema funcional de um microscópio confocal. O detector registra a fluorescência de um</p><p>único ponto da amostra em foco. A imagem é obtida pela varredura bidimensional e pela variação do</p><p>plano focal, a informação de cada ponto é registrada e utilizada para produzir uma reconstrução</p><p>tridimensional da amostra. A imagem resultante apresenta grande nitidez por não apresentar</p><p>interferência luminosa de outros planos focais.</p><p>Preparo de amostras para microscopias ópticas</p><p>Para produzir imagens contendo informações fidedignas, a preservação de estruturas e o realce de características</p><p>físico-químicas locais durante o preparo da amostra são necessários. Para tanto, esse preparo envolve passos de</p><p>fixação e coloração, que podem ser planejados de acordo com o tipo de amostra e as características a serem</p><p>reveladas. Um preparado permanente ideal deveria mostrar as células com a mesma estrutura microscópica e a</p><p>composição química que tinham quando vivas. Isso, entretanto, não é possível, e todos os preparados apresentam</p><p>artefatos, que são alterações produzidas nas células pelas técnicas utilizadas, como a dilatação ou a contração da</p><p>amostra e as alterações de pH e força iônica em compartimentos celulares. Os preparados exigem, portanto,</p><p>planejamento adequado para preservação de padrões químicos e morfológicos o mais próximo possível da</p><p>realidade.</p><p>Os métodos mais comuns de observação em microscopia óptica possibilitam a confecção dos preparados</p><p>permanentes (lâminas), nos quais as células são preservadas, isto é, fixadas e coradas para melhor demonstração</p><p>dos seus componentes.</p><p>Fixação</p><p>Primeira etapa para a obtenção de um preparado permanente. Apresenta as seguintes finalidades:</p><p>Preservar estruturas e componentes celulares</p><p>Impedir a difusão de componentes moleculares, conservando o posicionamento de elementos que definem</p><p>aspectos físico-químicos na célula</p><p>Evitar a autólise, que é a destruição da célula por suas próprias enzimas</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>Impedir a atividade e a proliferação de bactérias</p><p>Endurecer as células para que elas resistam às etapas seguintes da técnica</p><p>Manter ou aumentar a afinidade entre as estruturas celulares pelos corantes utilizados na microscopia óptica e</p><p>aumentar o contraste na microscopia eletrônica (tópico abordado adiante neste capítulo).</p><p>Pretende-se assim, manter a amostra em um estado preservado, o mais similar possível do real.</p><p>Tipos de fixação</p><p>Existem métodos físicos e químicos para fixar uma amostra biológica. Os métodos físicos consistem em</p><p>diferentes tratamentos térmicos, como: aquecimento (sob pressão ou não, pelo uso de micro-ondas) e</p><p>congelamento (criopreservação). O uso desses métodos é bastante limitado, sendo mais comuns os tratamentos</p><p>por micro-ondas e congelamento, por possibilitarem ou facilitarem a exposição de epítopos (partes de estruturas</p><p>maiores – antígenos – capazes de produzir resposta imunológica – anticorpos) para uso de anticorpos como</p><p>marcadores.</p><p>Métodos químicos envolvem a exposição da amostra à solução fixadora ou ao seu vapor, por imersão ou sua</p><p>perfusão, geralmente bombeando a solução fixadora pelo sistema vascular de tecidos de difícil impregnação. O</p><p>objetivo dessas soluções é preservar estruturas por meio de ligações covalentes cruzadas, entre outros tipos de</p><p>interações (Figura 3.7 e boxe Fixação química).</p><p>Fixação química</p><p>A química da fixação é complexa e pouco conhecida. Esse processo pode envolver a formação</p><p>de adutos ou a desnaturação de proteínas ou a geração de ligações covalentes cruzadas entre</p><p>componentes celulares, podendo ainda ocorrer todos esses fenômenos em diferentes</p><p>extensões. Fixadores que formam ligações cruzadas criam redes tridimensionais, retendo</p><p>diferentes componentes celulares e imobilizando moléculas pequenas, conferindo alguma</p><p>resistência à amostra.</p><p>O formol (formaldeído ou metanal) e o aldeído glutárico (glutaraldeído ou pentanodial)</p><p>fixam as células por reagirem com os grupos amina das proteínas, produzindo ligações</p><p>cruzadas (ver Figura 3.7). Podem ainda polimerizarem-se e originar cadeias que também</p><p>participam da fixação. O glutaraldeído contém um grupamento aldeídico em cada</p><p>extremidade de sua molécula, sendo capaz de estabelecer pontes entre as unidades</p><p>proteicas, estabilizando a estrutura quaternária da proteína.</p><p>Cada fixador apresenta atributos diferentes, como velocidade de difusão na amostra,</p><p>capacidade de fixar estruturas pequenas ou grandes e de formar polímeros curtos ou longos,</p><p>entre outras propriedades dependentes de suas estruturas químicas. Para preservar uma</p><p>amostra, essas diferenças apresentam determinados inconvenientes, ao lado de algumas</p><p>qualidades desejáveis; por isso, foram elaboradas as misturas fixadoras, que contêm</p><p>proporções variáveis dos fixadores componentes com a finalidade de compensar-lhes as</p><p>deficiências.</p><p>Figura 3.7 A. Um dos mecanismos possíveis de formação de ligações cruzadas (crosslinking) entre</p><p>componentes celulares: R-NH2 representa uma cadeia peptídica com um grupo amina exposto. B.</p><p>Representação de cadeias resultantes da polimerização de formaldeído e glutaraldeído,</p><p>o que</p><p>possibilita ligações cruzadas entre componentes com distâncias variáveis.</p><p>Microtomia</p><p>A microscopia óptica exige que a luz seja transmitida através da amostra, que devidamente preparada, revela</p><p>detalhes de sua estrutura interna. Em sua maioria, as células fazem parte de tecidos que precisam ser cortados em</p><p>fatias finas para exame no microscópio. Esses cortes são feitos em um equipamento denominado “micrótomo”</p><p>(Figura 3.8). Para ser cortado no micrótomo, o fragmento de tecido fixado é geralmente protegido, mediante um</p><p>processo de inclusão, por um material que o envolve e nele penetra, o qual é denominado “meio de inclusão”.</p><p>Este age como um meio de suporte, que confere rigidez e propriedades físicas que facilitam o corte e evitam o</p><p>rompimento da amostra durante o procedimento. As amostras são incluídas em parafina ou em resinas plásticas</p><p>especiais e cortadas com uma espessura de 1 a 6 μm, geralmente. Para estudo no microscópio eletrônico, os</p><p>tecidos devem ser incluídos em resinas mais rígidas, como as do tipo epóxi. Os cortes para o microscópio</p><p>eletrônico são muito finos, usualmente, medindo 100 nm ou menos.</p><p>Coloração</p><p>Usualmente todas as estruturas celulares são transparentes e incolores. Para uma análise de preparados</p><p>permanentes por microscopia óptica, é necessário um processo de coloração da amostra que torna visíveis os</p><p>diferentes componentes celulares. A maioria dos corantes apresenta um grupo químico responsável pela cor –</p><p>grupo cromóforo (khrõma, cor, e phorós ou portador) – que confere um caráter básico ou ácido (sendo catiônico</p><p>ou aniônico, respectivamente). Corantes básicos combinam-se a grupos ácidos (aniônicos) dos componentes</p><p>celulares, portanto as moléculas ácidas, como as do ácido desoxirribonucleico (DNA) e do ácido ribonucleico</p><p>(RNA), denominam-se basófilas, isto é, têm afinidade pelos corantes básicos (como a hematoxilina). Estruturas</p><p>ricas em grupos básicos, como as proteínas citoplasmáticas, são nomeadas de acidófilas, por terem afinidade</p><p>pelos corantes ácidos (eosina).</p><p>Figura 3.8 Micrótomo moderno, especialmente ergonômico, para cortes de tecidos incluídos em</p><p>parafina ou em resina plástica. Modelo ErgoStar HM 200. (Ilustração gentilmente cedida pela Microm,</p><p>empresa do grupo Carl Zeiss.)</p><p>Microscopia eletrônica</p><p>A capacidade resolutiva de qualquer microscópio é limitada pelo comprimento de onda da radiação empregada.</p><p>A radiação visível possibilita distinguir detalhes de 0,2 μm; porém, detalhes de objetos menores não são visíveis</p><p>neste espectro.</p><p>O microscópio eletrônico (Figura 3.9) emprega feixes de elétrons que, acelerados por uma diferença de</p><p>potencial de 60 kV, apresentam um comprimento de onda de 0,005 nm. No momento, não se consegue aproveitar</p><p>inteiramente a capacidade resolutiva dos melhores microscópios eletrônicos em virtude das dificuldades de</p><p>preservação das células e, sobretudo, de obtenção de cortes extremamente finos, imprescindíveis para a resolução</p><p>máxima.</p><p>Os componentes do microscópio eletrônico, representados de modo esquemático, lembram um microscópio</p><p>óptico (Figura 3.10). Os elétrons são produzidos devido ao aquecimento, no vácuo, de um filamento de</p><p>tungstênio – o cátodo – que emite elétrons. Essas partículas são aceleradas por uma diferença de potencial de 60</p><p>a 100 kV existente entre o cátodo e o ânodo. Este último é uma placa perfurada no centro e só permite a</p><p>passagem de parte dos elétrons, formando um feixe. Os elétrons passam por uma bobina ou lente magnética,</p><p>também denominada “condensadora”, que os direciona em feixe uniforme na direção do objeto. Após atravessar</p><p>o objeto, no qual muitos elétrons são desviados, o feixe transpassa por outra bobina, que corresponde à lente</p><p>objetiva do microscópio óptico. Por fim, uma terceira bobina projeta os elétrons sobre uma tela fluorescente – na</p><p>qual eles formam uma imagem visível – ou sobre um filme ou sensor fotográfico.</p><p>Figura 3.9 Microscópio eletrônico, modelo EM910 da empresa Carl Zeiss. (Cortesia do fabricante.)</p><p>Figura 3.10 Trajeto dos elétrons no microscópio eletrônico. O corte de tecido é colocado logo acima</p><p>da bobina ou lente objetiva. A imagem, já aumentada pela lente objetiva, é novamente ampliada por</p><p>outra bobina, que a projeta em uma tela fluorescente.</p><p>Os elétrons desviados por determinadas estruturas da célula em estudo não contribuirão para formar a</p><p>imagem. Essas estruturas aparecem escuras e são intituladas eletrodensas. Os componentes celulares que</p><p>desviam uma pequena porcentagem de elétrons aparecerão em variadas tonalidades de cinza.</p><p>A tela fluorescente em que a imagem se forma é uma placa revestida por sulfeto de zinco (ZnS) ou</p><p>compostos de fósforo, substâncias que emitem luz ao serem excitadas pelos elétrons. Na prática, as observações</p><p>mais cuidadosas são efetuadas nas micrografias obtidas pela retirada da tela do trajeto dos elétrons, os quais</p><p>incidirão sobre sensor fotográfico.</p><p>As análises de imagens de microscopia eletrônica são realizadas principalmente em ampliações em papel</p><p>fotográfico ou em monitores, em vez de diretamente no microscópio eletrônico. Dois motivos dificultam sua</p><p>observação direta e prolongada: a tela fluorescente, constituída por partículas relativamente grosseiras e com</p><p>pouca emissão de luz em relação aos elétrons que recebe, fornecendo imagens menos contrastadas do que as</p><p>obtidas nas ampliações fotográficas; e a amostra exposta ao feixe de elétrons degrada-se, dificultando longas</p><p>exposições.</p><p>O poder de resolução dos microscópios eletrônicos pode ser combinado com uma técnica de marcação</p><p>denominada immunogold ou marcação por ouro coloidal, descrita no tópico “Imunocitoquímica e sondas</p><p>moleculares”. Nesse método, partículas de ouro são ligadas à proteína A ou a anticorpos específicos. Quando</p><p>aplicadas em amostras sendo preparadas para microscopia eletrônica, essas partículas produzem regiões</p><p>eletrodensas visíveis ao microscópio eletrônico, evidenciando a localização de componentes celulares ou</p><p>substâncias com precisão superior à de técnicas de microscopia óptica. Utilizando-se partículas de tamanhos</p><p>diferentes (usualmente entre 15 e 50 nm), é possível fazer marcações simultâneas em uma mesma amostra.</p><p>Preparo de amostras para microscopia eletrônica</p><p>A preparação de amostras para a microscopia eletrônica requer cuidados muito especiais. Em geral, a fixação é</p><p>feita em solução de glutaraldeído tamponado a pH 7,2. Utiliza-se também a fixação em solução de tetróxido de</p><p>ósmio. Na maioria das vezes, esses dois fixadores são empregados em sequência: primeiro fixa-se o tecido em</p><p>glutaraldeído e, depois, em ósmio. O ósmio, além de fixador, atua como contraste, por ser um elemento de massa</p><p>atômica elevada, que desvia os elétrons. As estruturas que se combinam com o ósmio aparecerão escuras.</p><p>Além do ósmio, outros átomos são empregados para fixar e aumentar o contraste entre os componentes</p><p>celulares. Após a fixação com glutaraldeído, seguida daquela com ósmio, podem-se passar ainda as células por</p><p>soluções de sais de urânio ou chumbo. Como as variadas estruturas celulares têm afinidades diferentes por esses</p><p>metais, o contraste melhora quando mais de um deles é utilizado.</p><p>O poder de penetração dos feixes de elétrons utilizados nos microscópios eletrônicos é fraco, por isso, as</p><p>amostras devem ser cortadas com uma espessura de 20 a 100 nm. Para isso, é necessária a inclusão em resina</p><p>epóxi. Os cortes são feitos em micrótomos que utilizam navalhas de vidro fraturado ou de diamante (Figura</p><p>3.11).</p><p>Microscópio eletrônico de varredura</p><p>Como o microscópio eletrônico comum ou de transmissão, o microscópio eletrônico de varredura também usa</p><p>um feixe de elétrons. Mas, daí em diante, eles pouco têm em comum e, na verdade, são aparelhos</p><p>complementares. O microscópio eletrônico de transmissão tem poder de resolução muito maior, enquanto o de</p><p>varredura tem a vantagem de fornecer imagens tridimensionais, pelo exame da superfície das estruturas.</p><p>O microscópio eletrônico de varredura (Figura 3.12) consiste em um sistema análogo ao do microscópio de</p><p>transmissão, que produz um</p><p>feixe delgado de elétrons cujo diâmetro pode ser modificado. O trajeto do feixe de</p><p>elétrons é, em seguida, modificado por um conjunto de bobinas defletoras que o fazem percorrer o espécime</p><p>ponto a ponto e ao longo de linhas paralelas (varredura).</p><p>Figura 3.11 Algumas etapas da obtenção dos cortes para a microscopia eletrônica. Os tecidos são</p><p>incluídos em blocos de resina epóxi. A. Observam-se o suporte do micrótomo com o bloco a ser</p><p>cortado e a navalha de vidro. Preso à navalha, há um pequeno recipiente contendo água, sobre a</p><p>qual os cortes serão recolhidos. B. Cortes coletados em uma tela de 3 mm de diâmetro, manejada por</p><p>meio de uma pinça. C. Tela com os cortes: submetida à solução de sais de uranila e chumbo que</p><p>impregnam os componentes celulares, aumentando seu contraste. Em seguida, a tela é levada ao</p><p>microscópio eletrônico.</p><p>Ao atingirem o espécime, os elétrons provocam diferentes efeitos, entre os quais a emissão de elétrons</p><p>secundários pelo próprio espécime. Os elétrons secundários são detectados por um coletor, passam por um</p><p>sistema de amplificação e são transformados em pontos de maior ou menor luminosidade, em um monitor de</p><p>vídeo ou em um arquivo digital. As micrografias são produzidas pelos dados de luminosidade dos elétrons</p><p>secundários em relação à posição do feixe de elétrons no momento da varredura, e não pela ação dos próprios</p><p>elétrons do feixe primário em um filme fotográfico, como acontece no microscópio eletrônico de transmissão.</p><p>Geralmente, os espécimes não precisam ser cortados para serem examinados no microscópio eletrônico de</p><p>varredura. Objetos de 1 cm ou mais podem ser examinados inteiros. Em Biologia Celular, o microscópio de</p><p>varredura tem sido muito utilizado para o estudo da superfície de células mantidas em cultivo. O material a ser</p><p>estudado, após fixação em glutaraldeído ou outro fixador, é cuidadosamente desidratado e recoberto por delgada</p><p>camada condutora de eletricidade – em geral ouro ou platina, depositados a vácuo – e está pronto para ser</p><p>examinado no aparelho.</p><p>Figura 3.12 Esquema geral do microscópio eletrônico de varredura: na parte inferior do aparelho</p><p>estão localizadas as bombas de vácuo, pois a coluna percorrida pelos elétrons deve ser mantida em</p><p>alto vácuo.</p><p>Microscopia de fluorescência</p><p>Esta é um subtipo de microscopia óptica fundamentada em moléculas fluorescentes, também conhecidas como</p><p>fluoróforos, muito utilizada para detectar proteínas ou estruturas celulares específicas. Em alguns casos, explora-</p><p>se a fluorescência intrínseca de elementos celulares; em outros, os fluoróforos são acoplados a anticorpos</p><p>específicos, tornando-se uma ferramenta central na imunofluorescência. Essa técnica é muito popular, porque</p><p>conjuga a especificidade de detecção fornecida pelo anticorpo com a facilidade de visualização fornecida pelo</p><p>fluoróforo (ver tópico “Imunocitoquímica e sondas moleculares”).</p><p>Fluoróforos têm origem e propriedades variadas: podem ser proteínas ou biomoléculas pequenas</p><p>naturalmente fluorescentes ou compostos químicos sintetizados artificialmente. Fluoróforos são moléculas</p><p>excitáveis que emitem luz na presença de radiação de alta energia. Resumidamente, ao absorver um fóton de alta</p><p>energia, um elétron de seu orbital molecular passa para um estado excitado; ao retornar ao seu estado de menor</p><p>energia, um novo fóton de comprimento de onda maior será emitido (Figura 3.13). Cada fluoróforo responde a</p><p>um comprimento de onda específico (luz de excitação) e emite um comprimento de onda próprio (luz de</p><p>emissão). Assim, um preparado pode ser simultaneamente marcado com fluoróforos distintos, excitados por</p><p>comprimento de onda diferentes. Se cada fluoróforo evidencia estruturas diferentes da amostra, como núcleo,</p><p>citoesqueleto de actina e proteínas de membrana, essas estruturas emitirão – sob a microscopia de fluorescência –</p><p>comprimentos de ondas (ou cores) distintos. Para o usuário, a amostra apresenta-se colorida, de acordo com a</p><p>localização da estrutura.</p><p>Como exemplo do primeiro caso, têm-se alguns constituintes celulares, como a riboflavina (vitamina B2), a</p><p>vitamina A e as porfirinas, que são fluorescentes e podem ser identificados e localizados por meio da</p><p>microscopia de fluorescência.</p><p>No segundo caso, incluem-se os corantes fluorescentes, que se combinam e identificam determinadas</p><p>biomoléculas que não têm fluorescência própria normalmente presentes nas células. Um dos corantes</p><p>fluorescentes mais utilizados é o alaranjado de acridina, que se combina aos ácidos nucleicos, promovendo sua</p><p>localização.</p><p>O microscópio de fluorescência utiliza lâmpadas de radiação ultravioleta ou raios laser com comprimentos de</p><p>onda definidos como fontes de radiação de excitação do fluoróforo. A microscopia de fluorescência usa filtros de</p><p>luz que possibilitam passagem seletiva de comprimentos de onda específicos, os quais escolhemos de acordo</p><p>com os fluoróforos utilizados no preparado. Essa técnica pode ser realizada com múltiplos fluoróforos, e a</p><p>observação do fenômeno da fluorescência é simultâneo, A microscopia de fluorescência torna possível análises</p><p>detalhadas e identificação de possíveis colocalizações.</p><p>Figura 3.13 A. Representação do processo de fluorescência: um fluoróforo recebe energia movendo</p><p>um elétron de seu orbital molecular para um estado excitado, ao decair uma nova radiação de menor</p><p>energia será emitida. B. Representação dos espectros de absorção e de emissão de um fluoróforo.</p><p>Imunocitoquímica e sondas moleculares</p><p>As técnicas de imunocitoquímica viabilizam o estudo da localização intracelular de proteínas específicas. Ela</p><p>identifica com precisão uma determinada proteína, excluindo todas as outras que não se enquadrem no perfil</p><p>procurado.</p><p>Como a imunocitoquímica baseia-se na reação antígeno–anticorpo, devem-se estudar antes algumas noções</p><p>básicas dessa reação que pertence ao domínio da imunologia. Textos de imunologia devem ser consultados para</p><p>mais esclarecimentos.</p><p>Imunocitoquímica direta</p><p>Nessa estratégia experimental, utiliza-se apenas o anticorpo que reconhece o alvo antigênico (epítopo) de</p><p>interesse. Esse anticorpo, conhecido como primário, é diretamente acoplado a um elemento detector, que pode</p><p>ser uma enzima ou um fluoróforo. Por exemplo, colocando-se sobre um corte do órgão de rato que contém a</p><p>proteína X uma solução do anticorpo marcado com a peroxidase, haverá uma combinação do antígeno (proteína</p><p>X) com seu anticorpo (gamaglobulina anti-X) marcado com peroxidase (Figura 3.14). O complexo antígeno–</p><p>anticorpo formado não é visível ao microscópio óptico nem ao eletrônico, mas tornar-se-á visível se a peroxidase</p><p>for evidenciada por uma reação citoquímica apropriada.</p><p>Essa evidenciação ocorre ao se colocar sobre o corte uma substância que, sob a ação da peroxidase, forme um</p><p>composto corado e eletrodenso. Em outras palavras, utiliza-se um substrato que, por ação enzimática, produza</p><p>uma substância colorida. No exemplo da Figura 3.14, o composto (substrato) sobre o qual a peroxidase (enzima)</p><p>atua é a 3-3′-diaminobenzidina, que, ao ser atacada pela peroxidase, se transforma em um composto insolúvel,</p><p>marrom-claro e eletrodenso. É interessante que esse marcador colorido seja insolúvel e sofra pouca ou nenhuma</p><p>difusão, evitando que o sinal esmaeça ou prejudique a visualização de sua origem.</p><p>Em substituição à peroxidase, pode-se usar, como marcador, um corante fluorescente ligado ao anticorpo</p><p>(Figura 3.15). Nesse caso, o preparado obtido pela ação do anticorpo sobre o corte que contém o antígeno pode</p><p>ser imediatamente examinado ao microscópio de fluorescência. Todavia, a peroxidase proporciona melhor</p><p>localização, pois o corte pode ser estudado com o microscópio eletrônico e o antígeno identificado, com alta</p><p>resolução, nas organelas celulares.</p><p>Uma terceira maneira de marcar o anticorpo consiste em sua conjugação com a ferritina, uma proteína que,</p><p>em virtude do seu alto teor em ferro, é muito eletrodensa e possibilita o estudo da localização de proteínas</p><p>(antígenos) ao microscópio eletrônico. Essa marcação não serve para o estudo ao microscópio</p><p>óptico.</p><p>Outro método bastante versátil utiliza marcação com o complexo de ouro coloidal + proteína A, ou ouro</p><p>coloidal + anticorpos (Figuras 3.16 e 3.17). Essa técnica, chamada “immunogold” ou “marcação por ouro</p><p>coloidal”, consiste na adsorção, pelas moléculas da proteína A, de partículas de ouro, muito pequenas (5 a 20</p><p>nm) e eletrodensas. A proteína A é extraída das bactérias Staphylococcus aureus e, além da atração pelo ouro</p><p>coloidal, tem afinidade por uma região comum às moléculas de todos os anticorpos (segmento Fc). Essa técnica</p><p>apresenta grande precisão para localizar proteínas e grande resolução, pois as partículas de ouro coloidal são</p><p>muito pequenas. O processo pode ser realizado nas seguintes etapas:</p><p>Figura 3.14 Técnica imunocitoquímica direta. O composto (precipitado) formado pela ação da</p><p>peroxidase na 3-39-diaminobenzidina é eletrodenso e de coloração marrom-clara. Por isso, a técnica</p><p>pode ser aplicada tanto à microscopia óptica como à eletrônica.</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>Figura 3.15 Imunocitoquímica direta com anticorpo fluorescente.</p><p>Figura 3.16 Desenhos esquemáticos mostrando os fundamentos da técnica de imunocitoquímica,</p><p>utilizando como marcador o complexo de proteína A (uma proteína de estafilococo) e partículas de</p><p>ouro coloidal.</p><p>Incubar o tecido a ser estudado com o anticorpo desejado e lavá-lo; o anticorpo, então, fixa-se à proteína</p><p>Incubar o tecido em solução de ouro conjugado à proteína A e lavá-lo</p><p>Estudar no microscópio eletrônico.</p><p>A técnica direta de imunocitoquímica não é muito sensível e, por isso, pouco utilizada atualmente. Ela foi</p><p>descrita para facilitar a compreensão da técnica indireta, muito mais útil na prática por sua alta sensibilidade.</p><p>Imunocitoquímica indireta</p><p>Nessa técnica, a marcação é colocada em um segundo anticorpo, denominado “anticorpo secundário”, e</p><p>reconhece a porção constante do anticorpo primário. É, portanto, um antianticorpo, isto é, uma</p><p>antigamaglobulina. Essa técnica é mais sensível (Figura 3.18), pois amplia o sinal do anticorpo primário e</p><p>possibilita a detecção de quantidades mínimas de antígeno. A técnica de imunocitoquímica indireta é a mais</p><p>utilizada na prática em pesquisa.</p><p>Figura 3.17 Eletromicrografia de um preparado total da bactéria Haemophilus aegyptius, causadora</p><p>da febre purpúrica brasileira. Notem-se dois tipos celulares, em que as células assinaladas por</p><p>estrelas mostram projeções filamentosas marcadas pelo complexo proteína A–ouro, ligado a um</p><p>antissoro policlonal anti-25 kD. A proteína 25-kD é uma subunidade proteica da fímbria. A célula</p><p>assinalada por um asterisco não mostra projeções filamentosas. Observa-se, em algumas</p><p>oportunidades, a disposição linear (que revela a estrutura filamentosa da fímbria, seta) das partículas</p><p>de ouro elétron-dispersantes, que medem aproximadamente 5 nm de diâmetro. Aumento: 63.000×.</p><p>(Imagem cedida gentilmente pela Dra. Hatune Tanaka do Instituto Adolfo Lutz, São Paulo.)</p><p>Figura 3.18 Esquema para demonstrar a maior sensibilidade da imunocitoquímica indireta. Pela</p><p>técnica direta, esse antígeno celular fixaria quatro moléculas do anticorpo; pela técnica indireta, ele</p><p>fixou 20 moléculas de antigamaglobulina.</p><p>As etapas da técnica indireta, que utiliza dois anticorpos, estão esquematizadas na Figura 3.19. Supondo-se</p><p>que se queira saber a localização celular da proteína Y, também contida em um órgão de rato, a primeira etapa</p><p>consiste na colocação, sobre o corte de tecido, de uma solução do anticorpo (gamaglobulina) anti-Y, obtido pela</p><p>injeção da proteína Y em um coelho. Haverá combinação de Y com seu anticorpo.</p><p>Na segunda etapa, coloca-se sobre o corte uma solução de anticorpo contra gamaglobulina de coelho. Esse</p><p>anticorpo, que é uma antigamaglobulina e, portanto, um antianticorpo, pode ser obtido pela injeção de</p><p>gamaglobulina de coelho em carneiro ou cabra.</p><p>Por fim, ter-se-á um complexo constituído pela proteína Y, seu anticorpo e uma antigamaglobulina. A</p><p>antigamaglobulina pode ser evidenciada por conjugação com substâncias fluorescentes (Figura 3.20) – ferritina</p><p>ou peroxidase –, conforme foi descrito na técnica direta.</p><p>Figura 3.19 Esquema demonstrativo das etapas da técnica imunocitoquímica indireta. Na etapa 1, o</p><p>antígeno cuja localização se deseja determinar combina-se ao anticorpo específico, formando um</p><p>complexo que não é visível nem no microscópio óptico, tampouco no eletrônico. A finalidade das</p><p>etapas seguintes é tornar esse complexo visível. Na etapa 2, agrega-se antigamaglobulina marcada</p><p>com peroxidase ao complexo já formado. Na etapa 3, por meio da técnica citoquímica para</p><p>peroxidase, forma-se precipitado visível nos microscópios óptico e eletrônico, revelando-se assim o</p><p>local do antígeno procurado.</p><p>Figura 3.20 Exemplo de imunocitoquímica indireta. Células de muntíaco, cujo citoesqueleto de</p><p>tubulina (filamentos azuis) foi marcado com antialfatubulina (camundongo) e revelado com anti-IgG de</p><p>camundongo (cabra) marcado com Alexa FLuor® 350; Golgi (em verde) foi marcado com lectina</p><p>conjugada com Alexa FLuor® 488 e peroxissomos (pontos laranja) foram evidenciados com</p><p>antiperoxissomo (coelho) e revelado com anti-IgG de coelho (asno) conjugado com Alexa FLuor® 555.</p><p>(Imagem cedida por ThermoFischer®.)</p><p>ELISA e testes diagnósticos</p><p>Um ensaio bioquímico muito sensível desenvolvido nos anos 1970 usa anticorpos ligados a</p><p>enzimas e é bastante utilizado tanto em pesquisa como em diagnóstico clínico. O ensaio de</p><p>imunoabsorção enzimática, mais conhecido como ELISA (do inglês enzyme-linked</p><p>immunosorbent assay), possibilita a quantificação da interação antígeno–anticorpo em</p><p>amostras, por meio de uma reação enzimática que gera um produto colorido. Usualmente a</p><p>amostra cujo antígeno de interesse é adsorvida em uma superfície sólida, sobre esta é</p><p>aplicada uma solução contendo o anticorpo, específico contra o antígeno em estudo, o qual é</p><p>ligado covalentemente a uma enzima. Após a interação antígeno–anticorpo, os anticorpos</p><p>livres são removidos e permanecem apenas os anticorpos ligados ao antígeno na superfície.</p><p>Os anticorpos remanescentes são detectados ao serem expostos a uma solução contendo o</p><p>substrato da enzima, geralmente constituindo um produto colorido que será quantificado em</p><p>um espectrofotômetro ou colorímetro.</p><p>A intensidade do sinal é proporcional à quantidade de anticorpo remanescente, que por</p><p>sua vez é correspondente à concentração do antígeno. O método é facilmente adaptável a</p><p>diferentes aplicações e à automatização. Existem muitas soluções comerciais que utilizam</p><p>placas padronizadas com 96 poços, denominadas “leitoras de ELISA”, que realizam</p><p>automaticamente leituras de amostras e padrões de comparação. Uma aplicação comum é a</p><p>detecção de anticorpos contra infecções ou autoimunes em plasma sanguíneo.</p><p>Outras sondas</p><p>Algumas moléculas têm afinidade natural por biomateriais específicos. Quando essas moléculas apresentam</p><p>outras propriedades que facilitam seu uso em células, como tamanho reduzido e baixa toxicidade, tornam-se</p><p>interessantes sondas ou traçadores. Assim como com os anticorpos, essas sondas podem ser marcadas com</p><p>fluoróforos, isótopos radioativos ou marcadores eletrodensos, entre outros. A seguir serão descritas as sondas</p><p>mais popularmente utilizadas no estudo da Biologia Celular.</p><p>Faloidina</p><p>Toxina oriunda do cogumelo Amanita phalloides, consiste em um heptapeptídio bicíclico que apresenta alta</p><p>afinidade e especificidade por actina, formando complexos que estabilizam os filamentos, impedindo sua</p><p>despolimerização. É um exemplo de sonda molecular. Essa toxina é menor que um anticorpo e apresenta</p><p>diferentes sítios em suas cadeias laterais que possibilitam a ligação covalente de marcadores sem afetar sua</p><p>afinidade. Pode ser utilizada em preparações com células permeabilizadas com surfactantes ou aplicada por</p><p>microinjeção. Produz imagens de ótima qualidade do citoesqueleto de actina, sendo utilizada rotineiramente em</p><p>diversos tipos de preparações (Figura 3.21).</p><p>Lectinas</p><p>Proteínas presentes em todos os seres vivos, têm afinidade e especificidade com carboidratos. Devido a sua</p><p>grande variedade,</p><p>existem lectinas que reconhecem açúcares solúveis, glicoproteínas e glicolipídios.</p><p>Comercialmente existem opções dessas proteínas direcionadas para marcação do complexo de Golgi ou</p><p>reconhecendo glicoproteínas de superfície celular marcadas com fluoróforos ou enzimas, o que viabiliza a</p><p>identificação de tipos celulares, por exemplo, de células endoteliais. Soluções comerciais também utilizam</p><p>lectinas para tipagem sanguínea em laboratórios de análises clínicas.</p><p>Figura 3.21 Células endoteliais bovinas marcadas com faloidina ligada a diferentes fluoróforos. A.</p><p>Núcleo marcado com DAPI® e actina evidenciada com faloidina-Alexa Fluor® 680. B. Núcleo: SYTOX</p><p>Green® e actina: faloidina-Alexa Fluor® 568. C. Núcleo: 7-AAD e actina: faloidina-Alexa Fluor® 488. D.</p><p>Núcleo: TO-PRO 3® e actina: faloidina-Alexa Fluor® 350. (Imagem cedida por ThermoFischer®.)</p><p>DNA e RNA</p><p>O uso de DNA ou RNA como sondas explora a propriedade básica de pareamento de bases por</p><p>complementariedade (ver Capítulo 2). Essa propriedade é conhecida como hibridação e possibilita localizar</p><p>genes na cromatina e determinar padrões de expressão de mensageiros de RNA (mRNA) em tecidos ou</p><p>organismos inteiros, entre outras aplicações. Aqui, as sondas são fragmentos de DNA ou de RNA com sequência</p><p>nucleotídica complementar ao gene de interesse. As sondas são marcadas com traçadores fluorescentes ou</p><p>radioativos. No caso da detecção de genes na cromatina, a dupla-hélice de DNA da amostra é mantida por pontes</p><p>de hidrogênio, que são forças fracas. Essas duas cadeias podem ser separadas facilmente pelo aquecimento</p><p>brando, expondo as bases para serem reconhecidas pela sonda. A sonda só forma um par híbrido com o alvo</p><p>específico devido à complementaridade de bases. Processo semelhante ocorre com o RNA, que pode se combinar</p><p>tanto com sondas de DNA quanto de RNA.</p><p>Corantes e ensaios in vivo</p><p>Os primeiros estudos utilizando microscopia como ferramenta para caracterizar aspectos morfológicos de células</p><p>e tecidos (na época denominados “microanatomia”) eram de observação direta ou utilizavam corantes</p><p>naturalmente disponíveis, como alizarina (extraído de raízes de garança – Rubia tinctorum), açafrão ou anil</p><p>(derivado do índigo/anileira – Indigofera suffruticosa).</p><p>Com a revolução industrial e a crescente demanda por novos corantes na indústria têxtil, a histologia (nova</p><p>designação do estudo dos tecidos e células que os formam) e a microbiologia passaram a receber grandes</p><p>contribuições, com a disponibilidade de grande variedade de novos corantes e metodologias para fixar e colorir</p><p>amostras.</p><p>Durante o século XX, tornou-se comum o uso de corantes vitais, que são atóxicos e não comprometem o</p><p>funcionamento das células. A embriologia utilizou esse recurso de modo muito elegante e elaborado, corando</p><p>células ou tecidos de embriões e observando seu desenvolvimento normal, possibilitando observar in vivo a</p><p>origem de linhagens celulares e de tecidos, bem como seguir o movimento de massas celulares. Resultando na</p><p>criação de mapas detalhados do destino de blastômeros de diferentes organismos.</p><p>Na pesquisa de biologia celular, corantes vitais são úteis em ensaios de migração e de comunicação celular,</p><p>possibilitando visualizar e quantificar esses fenômenos celulares. De maneira análoga, esses corantes estão</p><p>presentes na Oftalmologia, realçando tecidos transparentes, com utilidade tanto cirúrgica quanto diagnóstica.</p><p>Genes repórteres</p><p>Os genes repórteres são ferramentas da biologia molecular que se destacam nas últimas décadas por propiciar</p><p>variadas aplicações. Os genes repórteres conferem alguma característica à célula ou ao organismo facilmente</p><p>identificável ou mensurável, sem prejudicar sua fisiologia. Mediante manipulações moleculares, sequências</p><p>desses genes podem ser inseridas em genomas de organismos ou em vetores (DNA plasmidial), associados a</p><p>promotores induzíveis ou fundidos a sequência de outro gene de interesse.</p><p>Um exemplo de gene repórter é aquele que codifica a proteína verde fluorescente (GFP, do inglês green</p><p>fluorescent protein), identificada na água-viva Aequorea victoria. Essa proteína apresenta 238 aminoácidos e</p><p>uma estrutura compacta (Figura 3.22). Uma das aplicações da GFP é acompanhar níveis de expressão ou</p><p>transporte e renovação da proteína de interesse. A adição da sequência de GFP à sequência gênica da proteína de</p><p>interesse forma uma proteína quimérica. A GFP usualmente não influencia no funcionamento de enzimas ou</p><p>proteínas estruturais, portanto a quimera se comporta como a proteína de interesse. E, com a GFP fusionada,</p><p>fluoresce quando exposta à luz azul ou ultravioleta, possibilitando assim localizar a quimera na célula ou no</p><p>organismo (ver Figura 3.22). A visualização da fluorescência de GFP torna possível análises in vivo de modo não</p><p>invasivo e não destrutivo.</p><p>Atualmente, existem muitos genes repórteres comercialmente disponíveis. Alguns desenvolvidos por</p><p>mutação sítio-dirigida do gene de GFP; outros elaborados a partir de genes de outros organismos, ou até</p><p>sintéticos. Os genes aprimorados apresentam como vantagens: maior eficiência quântica, estabilidade</p><p>conformacional em temperaturas mais altas, maior intensidade relativa de brilho e menor coeficiente de extinção.</p><p>Ensaios bioquímicos</p><p>Purificação celular</p><p>Vários procedimentos possibilitam a separação das células que constituem os tecidos. A primeira etapa</p><p>geralmente consiste na destruição da arquitetura da matriz extracelular (por meio de enzimas como colagenase e</p><p>tripsina) e das junções que unem as células, muito frequentes nos epitélios glandulares e de revestimento. Para</p><p>isso, é preciso retirar os íons Ca2+, que participam da aderência entre as células, com auxílio do ácido</p><p>etilenodiaminotetracético (EDTA, do inglês ethilenediaminetetraacetic acid), que possui ação quelante, ou seja,</p><p>capaz de formar complexos estáveis com íons metálicos, sem formar ligações covalentes. Depois de separadas,</p><p>as células continuam misturadas, e os tipos celulares desejados precisam ser isolados.</p><p>O isolamento das células pode ser realizado de diferentes maneiras, por exemplo, por centrifugação, de</p><p>acordo com seu tamanho e sua densidade. Algumas células, como os macrófagos, têm tendência a aderir ao vidro</p><p>e a plásticos e, assim, podem ser isoladas daquelas que não têm essa predisposição. Contudo, a maneira mais</p><p>precisa e eficiente de isolar um único tipo celular em grande quantidade é por meio de um aparelho denominado</p><p>“separador de células ativado por fluorescência/citômetro de fluxo” (FACS, do inglês fluorescence-activated cell</p><p>sorter). As células em suspensão são tratadas com um anticorpo fluorescente que se liga especificamente à</p><p>superfície de células específicas. À medida que a suspensão de células passa pelo aparelho, as células</p><p>fluorescentes são desviadas para um recipiente, e as não fluorescentes serão coletadas em outro recipiente.</p><p>Figura 3.22 A. A proteína GFP apresenta uma estrutura denominada “barril b”, com o cromóforo no</p><p>centro. Excelente marcador, pode ser ligada a outras proteínas sem afetar suas afinidades ou</p><p>atividades. B e C. Genes repórteres permitem a elaboração de experimentos de análise funcional e</p><p>podem ser utilizados virtualmente em qualquer modelo de estudo. Acima (B), tem-se uma placa de</p><p>Petri contendo colônias de bactérias expressando genes repórteres fluorescentes de diferentes cores;</p><p>abaixo (C), camundongos transgênicos expressando GFP em seu tegumento. (B, reproduzida de</p><p>Nathan Shaner; 2006. Disponível em: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:FPbeachTsien.jpg; C,</p><p>reproduzida de Credd7398; 2021. Disponível em:</p><p>https://commons.wikimedia.org/wiki/File:GFPPupsAndTestisForWiki.jpg)</p><p>Lise celular</p><p>Muitas técnicas exigem o rompimento da membrana celular e a exposição de seu conteúdo; esse processo é</p><p>denominado lise celular, e o conteúdo celular exposto é nomeado “lisado”.</p><p>Há variadas maneiras de lisar uma célula: mecanicamente (com o uso de rotores, descrito mais adiante),</p><p>enzimaticamente, por ultrassom e por ação química (p. ex., detergentes, solventes orgânicos, alteração osmótica</p><p>do meio, agentes desestabilizadores de membrana).</p><p>Em pesquisa, o método escolhido dependerá da análise a ser efetuada no lisado. No caso de ser necessário</p><p>recuperar organelas inteiras ou proteínas em seu estado natural, a lise mecânica ou o uso de um detergente</p><p>brando (não iônico) pode ser uma opção. Para recuperação de ácidos nucleicos geralmente detergentes fortes e</p><p>sais caotrópicos são utilizados, pois sua ação desnaturante ajuda a proteger a integridade do material genético</p><p>contra a ação de algumas nucleases.</p><p>Centrifugação diferencial e contragradiente</p><p>As técnicas que provocam o fracionamento celular e a obtenção de frações relativamente puras de organelas</p><p>contribuíram muito para o desenvolvimento da biologia celular.</p><p>As organelas são separadas pela centrifugação de um homogeneizado de células, em que as membranas</p><p>plasmáticas são rompidas e os constituintes celulares dispersos em um meio líquido, geralmente contendo</p><p>sacarose, que mantém a integridade dos componentes celulares e evita a tendência de as organelas aglutinarem-se</p><p>quando as células se rompem.</p><p>Em geral, a ruptura das membranas plasmáticas para a obtenção do homogeneizado decorre da ação</p><p>mecânica de um pistão girando em um cilindro que contém as células na solução de sacarose (Figura 3.23). Esse</p><p>fracionamento pode ser realizado também por meio de ultrassom ou trituração mecânica.</p><p>Durante a homogeneização e as centrifugações que se seguem, a maioria das organelas mantém sua forma</p><p>intacta. Todavia, o retículo endoplasmático se rompe, e, como suas membranas tendem a se resselar, formam-se</p><p>vesículas lisas ou granulares, conforme se trate do retículo endoplasmático liso (REL) ou do rugoso (RER). As</p><p>vesículas formadas a partir desse último, cuja superfície é carregada de ribossomos, recebem a denominação de</p><p>microssomos. Portanto, os microssomos são fragmentos do RER.</p><p>O isolamento de uma organela por meio da centrifugação depende do seu coeficiente de sedimentação, isto é,</p><p>do seu tamanho, sua forma e densidade, bem como da densidade e viscosidade da solução em que está sendo</p><p>centrifugada.</p><p>https://commons.wikimedia.org/wiki/File:FPbeachTsien.jpg</p><p>https://commons.wikimedia.org/wiki/File:GFPPupsAndTestisForWiki.jpg</p><p>Figura 3.23 Esquema da técnica de centrifugação diferencial. O sobrenadante de cada tubo é</p><p>centrifugado novamente, cada vez com maior força centrífuga. Os desenhos da direita mostram os</p><p>componentes celulares do sedimento de cada tubo. A força centrífuga é representada por G; 1.000 G</p><p>significam 1.000 vezes a força da gravidade.</p><p>A separação de componentes celulares por centrifugação em geral é efetuada pela técnica conhecida por</p><p>centrifugação fracionada ou centrifugação diferencial, que consiste em uma série de centrifugações a</p><p>velocidades crescentes (ver Figura 3.23). As organelas ou inclusões maiores e mais densas sedimentam primeiro,</p><p>e o sobrenadante de cada centrifugação é centrifugado novamente, porém com maior velocidade. Desse modo, os</p><p>componentes celulares vão sendo sucessivamente separados, como mostra a Figura 3.23. As frações com mais de</p><p>um componente celular podem ser purificadas por ressuspensão e nova centrifugação.</p><p>Em geral, o sobrenadante que permanece após a última centrifugação é denominado “fração solúvel”.</p><p>•</p><p>Outra técnica de fracionamento celular é a centrifugação contragradiente, em que as partículas são</p><p>separadas por suas diferenças de densidade. O gradiente consiste em uma solução – que pode ser de sacarose ou</p><p>sais de césio – cuja concentração é máxima na parte profunda do tubo de centrifugação e mínima na superfície.</p><p>Existe, portanto, no tubo, um gradiente de densidade crescente de cima para baixo. Logo após ter sido preparado</p><p>o gradiente, coloca-se o homogeneizado sobre sua superfície e procede-se à centrifugação. Impulsionadas pela</p><p>força centrífuga, as partículas penetram no gradiente. Cada tipo de partícula para no local em que há equilíbrio</p><p>entre a força centrífuga da partícula e a concentração do gradiente (Figura 3.24).</p><p>Figura 3.24 Centrifugação contragradiente. À esquerda, antes da centrifugação, com a amostra</p><p>colocada sobre o gradiente de concentração de sacarose. À direita, após a centrifugação, mostrando</p><p>as faixas, cada uma delas contendo, geralmente, um tipo de organela.</p><p>Uma vez isoladas, as organelas e as inclusões podem ser estudadas por diferentes métodos. Sua composição</p><p>química pode ser definida e sua atividade metabólica estudada fora da célula e, portanto, em um meio</p><p>rigorosamente controlado. Isoladas, as organelas não estão mais sujeitas aos mecanismos intracelulares de</p><p>controle, de modo que seu funcionamento pode ser testado mais livremente pelo pesquisador, embora as</p><p>condições sejam artificiais, em comparação com o meio intracelular.</p><p>Cromatografia em coluna</p><p>As proteínas e os ácidos nucleicos isolados das células são frequentemente separados pela técnica de</p><p>cromatografia em coluna. Essa técnica baseia-se no fato de que, quando se faz uma mistura de proteínas em</p><p>solução passar por uma coluna constituída por uma matriz sólida e porosa, contida em um tubo, a velocidade de</p><p>migração das diferentes proteínas varia conforme sua interação com a matriz (Figura 3.25). Mantendo-se um</p><p>fluxo contínuo de solvente (denominado “eluente”), que sai pela parte inferior da coluna, podem-se coletar</p><p>separadamente as proteínas contidas na amostra inicial.</p><p>O grau e o tipo de interação das proteínas com a matriz da coluna podem ser por (Figura 3.26):</p><p>Interação iônica: em que a matriz é constituída por partículas com carga positiva ou negativa, e a separação</p><p>das proteínas depende das cargas elétricas na superfície de suas moléculas</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>Figura 3.25 Cromatografia em coluna. Ao atravessar uma coluna cromatográfica, uma solução de</p><p>proteínas pode ser separada em frações de acordo com as interações de suas proteínas com a fase</p><p>estacionária da coluna. O eluente arrasta as proteínas através da fase estacionária: quanto menos</p><p>interações das proteínas com a matriz, mais rapidamente elas saem da coluna. Essas interações</p><p>podem ser por tamanho, como um filtro; iônicas, magnéticas ou por afinidade (p. ex., por anticorpos,</p><p>por metais). (Adaptada de Campbell e Farrell, 2007 [Figura 5.2].)</p><p>Interação hidrofóbica: as partículas da matriz apresentam superfície hidrofóbica, retardando a migração das</p><p>proteínas hidrofóbicas, que têm afinidade pelas partículas da matriz</p><p>Filtração em gel: nesse caso, a matriz atua apenas como uma peneira, por onde as proteínas migram com</p><p>velocidade variável, dependendo do tamanho e da forma de suas moléculas</p><p>Interação por afinidade: muitas moléculas biológicas interagem com alto grau de especificidade, como</p><p>acontece entre as enzimas e seus substratos, entre determinados segmentos de DNA e RNA, e entre antígenos</p><p>e anticorpos. A técnica é, por exemplo, muito utilizada para purificação de anticorpos. Nesse procedimento,</p><p>as moléculas (anticorpos) ligam-se às partículas da matriz que contêm o respectivo antígeno. As outras</p><p>proteínas passam pela coluna, mas os anticorpos se prendem à matriz com alta especificidade e afinidade.</p><p>Posteriormente à passagem das outras proteínas, o anticorpo é removido da coluna, por meio de solução</p><p>apropriada.</p><p>Figura 3.26 Tipos de cromatografias. A. Cromatografia de afinidade: a matriz (fase estacionária) tem</p><p>domínios com afinidade pela proteína de interesse. B. Filtração em gel ou “peneira molecular”: quanto</p><p>menor a partícula, mais ela interage com as cavidades da matriz e mais lentamente ela é eluída da</p><p>coluna. C. Cromatografia de interação iônica: a matriz é eletricamente carregada, partículas de</p><p>mesma carga movem-se mais rapidamente ao longo da coluna.</p><p>Eletroforese em gel</p><p>A eletroforese em gel é rotineiramente empregada para revelar o tamanho de proteínas ou ácidos nucleicos. O gel</p><p>é uma matriz porosa tridimensional que atua como suporte e meio de separação. Essa porosidade pode ser</p><p>controlada pela quantidade de reagentes no momento do preparo. A migração das biomoléculas por esse meio</p><p>sólido é direcionada pelo campo elétrico imposto sobre o gel.</p><p>O polo negativo é posicionado no local de</p><p>aplicação da amostra, e o polo positivo atrai as biomoléculas para o fim da matriz.</p><p>Gel de poliacrilamida</p><p>O gel de poliacrilamida separa proteínas em um campo elétrico em solução desnaturante de dodecilsulfato de</p><p>sódio (SDS). Esse composto é um detergente forte, cujas moléculas são carregadas negativamente. Quando há</p><p>excesso de moléculas negativas de SDS, todas as proteínas tornam-se também negativas, porque todas as cargas</p><p>positivas das proteínas são neutralizadas, restando apenas as cargas negativas da proteína e de associações entre</p><p>proteínas e SDS. Além disso, adiciona-se um agente redutor, geralmente β-mercaptoetanol ou ditiotreitol, que</p><p>rompe as ligações S-S (pontes dissulfeto) das subunidades proteicas, desnaturando as estruturas terciárias e</p><p>quaternárias das proteínas, que podem ser muito complexas. Colocando-se a mistura de proteínas em um gel e</p><p>submetendo-se este a um campo elétrico, todas as proteínas migrarão na direção do polo positivo, e a velocidade</p><p>dessa migração dependerá exclusivamente do tamanho da molécula de cada cadeia polipeptídica, pois todas as</p><p>proteínas terão uma forma alongada (Figura 3.27). Há diferentes variações dessa técnica que podem servir a</p><p>outros propósitos, como: purificar proteínas, revelar se existe interação entre proteínas ou entre uma proteína e</p><p>um ácido nucleico (técnica de gel-shift), ou determinar o ponto isoelétrico (PI) de proteínas (focalização</p><p>isoelétrica).</p><p>Após a separação das proteínas em gel de poliacrilamida, elas podem ser transferidas para uma membrana de</p><p>nitrocelulose ou outro material que possa formar ligações covalentes com os polipeptídios, como o poli(fluoreto</p><p>de vinilideno) (PVDF). O método Western blot (ou immunoblot) é uma técnica rotineira em pesquisa, que</p><p>possibilita quantificar proteínas em células e tecidos, e identificar modificações pós-traducionais.</p><p>Resumidamente, consiste em posicionar a membrana sobre uma das faces do gel de poliacrilamida contendo as</p><p>proteínas e aplicar um campo elétrico de modo que o ânodo esteja atrás da membrana. Dessa maneira, mantendo</p><p>o sistema em solução apropriada, as proteínas migram em direção à membrana e ficam retidas (ver Figura 3.27).</p><p>Proteínas específicas podem ser evidenciadas com uso de anticorpos, exibindo bandas definidas, separadas por</p><p>tamanho.</p><p>Figura 3.27 A. Separação de proteínas em gel de poliacrilamida desnaturante: as proteínas são</p><p>separadas por tamanho ao longo do gel de poliacrilamida em condições desnaturantes e</p><p>impulsionadas por um campo elétrico. B. Após a separação, essas proteínas podem ser transferidas</p><p>para uma membrana de nitrocelulose, ao montar um sistema que mantenha o gel e a membrana</p><p>embebidas (imersas) em solução tampão e aplicando um campo elétrico em outra direção.</p><p>Ácidos nucleicos também podem ser analisados por eletroforese em géis de poliacrilamida com o uso de</p><p>soluções apropriadas, no entanto, nas rotinas de laboratório, o meio de suporte mais comum para essas</p><p>eletroforeses é a agarose.</p><p>Gel de agarose</p><p>A agarose também forma uma matriz sólida por onde migra o DNA ou RNA. O gel de agarose tem sua</p><p>consistência mantida por pontes de hidrogênio. Seu preparo é muito simples e envolve apenas a dissolução da</p><p>agarose em solução-tampão e o aquecimento brando. Os ácidos nucleicos são biopolímeros conectados por</p><p>ligações fosfodiésteres (ver Capítulo 2), portanto têm carga negativa e são atraídos pelo polo positivo do campo</p><p>elétrico durante a separação. Comumente, para a visualização dos ácidos nucleicos após a eletroforese, inclui-se</p><p>um corante no gel. Esse corante (p. ex., brometo de etídio) penetra entre as cadeias de ácido nucleico e fluoresce</p><p>sob a radiação ultravioleta. Dessa maneira, podem-se revelar diferentes tamanhos de ácidos nucleicos.</p><p>Culturas celulares</p><p>As células retiradas do corpo de um animal ou de uma planta podem ser estudadas, por algum tempo, enquanto</p><p>estão vivas. Para isso elas devem ser colocadas em meio isotônico, que não lhes altera o volume. Como quase</p><p>sempre os constituintes celulares são incolores e transparentes, é necessário o uso do microscópio de contraste de</p><p>fase. Em alguns casos, podem-se empregar corantes vitais, que são pouco tóxicos e penetram na célula viva,</p><p>corando determinadas estruturas. Um corante vital bastante empregado é o janus green B, que cora as</p><p>mitocôndrias.</p><p>Quando se quer estudar células vivas por tempo mais prolongado, analisando seu comportamento e</p><p>metabolismo, costuma-se cultivá-las em soluções nutritivas (meios de cultura), que são condições mais bem</p><p>definidas do que no corpo de um animal. As culturas possibilitam o estudo dos movimentos celulares, da mitose,</p><p>da ação de diferentes substâncias sobre as células, e da secreção de produtos celulares que irão se acumular no</p><p>meio de cultura.</p><p>As culturas são realizadas principalmente em garrafas ou placas plásticas, com células isoladas dos tecidos</p><p>pela aplicação de variadas técnicas, como foi mencionado anteriormente. A maioria das células não vive em</p><p>suspensão em meio líquido, necessitando de uma superfície sólida sobre a qual crescem e se dividem. Essa</p><p>superfície pode ser a própria parede dos frascos de plástico em que são feitos os cultivos, porém, a maioria das</p><p>células não adere à parede do frasco, a não ser que esta esteja recoberta por moléculas teciduais extracelulares,</p><p>como o colágeno. O cultivo in vitro possibilita o emprego de meios de cultura quimicamente definidos,</p><p>constituídos por aminoácidos, glicídios, sais minerais, vitaminas e fatores de crescimento, que são proteínas</p><p>específicas, estimuladoras da proliferação e diferenciação de determinados tipos celulares. Um exemplo é o fator</p><p>de crescimento para células nervosas ou fator de crescimento nervoso (NGF, do inglês nerve growth fator).</p><p>As células retiradas do corpo de um animal e cultivadas diretamente constituem as culturas primárias. Em</p><p>geral, as células das culturas primárias morrem após quantidade definida de mitoses (50 a 100 mitoses), mas as</p><p>células imortalizadas e as células-tronco multiplicam-se indefinidamente. As células imortalizadas formam as</p><p>linhagens celulares, que não são constituídas de células inteiramente normais, pois sofreram alguma mutação,</p><p>sendo denominadas “células transformadas”. Todavia, elas conservam muitas características das células normais,</p><p>sendo muito utilizadas em variados experimentos.</p><p>As linhagens de células-tronco (stem cells) podem ser embrionárias ou induzidas. As embrionárias são</p><p>obtidas a partir da massa celular interna de blastocistos e são pluripotentes (ver Capítulo 17); as induzidas</p><p>(iPSCs, do inglês induced pluripotent stem cells) provêm de células somáticas reprogramadas por modulação da</p><p>expressão de fatores de transcrição específicos, por meio de manipulação genética (ver Capítulo 17). Essas</p><p>linhagens proliferam-se mantendo um estado indiferenciado (ou pouco diferenciado) e podem produzir tipos</p><p>celulares definidos. Diferentes tipos de células-tronco são foco de intensas pesquisas, tanto por contribuírem com</p><p>o entendimento do desenvolvimento de organismos, como por representarem possibilidades de terapias</p><p>regenerativas eficientes e inéditas.</p><p>Os cultivos vêm sendo utilizados para estudos do metabolismo de células normais e cancerosas e, além disso,</p><p>têm sido valiosos para experiências com vírus, que só se multiplicam no interior das células. Alguns protozoários</p><p>foram estudados, também, em culturas de células por se desenvolverem no citoplasma.</p><p>Na citogenética, as culturas celulares são de grande utilidade, facilitando muito o estudo dos cromossomos de</p><p>células vegetais e animais. Cariótipos humanos (estudo do número e morfologia dos cromossomos de uma</p><p>pessoa) geralmente são determinados em células na metáfase do ciclo mitótico. Nessa fase, os cromossomos</p><p>estão no seu estado mais condensado (ver Capítulo 10). Para isso, são realizadas em culturas de células do</p><p>sangue do paciente.</p><p>A cultura de células associada às técnicas de manipulação de material genético propiciou a compreensão de</p><p>vários mecanismos moleculares de</p><p>regulação gênica e de processos associados a patologias. Atualmente, existem</p><p>linhagens comerciais de células imortalizadas, culturas primárias, células-tronco embrionárias e induzidas, com</p><p>características genéticas definidas. Também estão disponíveis vetores artificiais, que são estruturas de DNA ou</p><p>RNA (ver tópico “Vetores”) que podem ser inseridas em células, contendo genes que podem ter sua transcrição</p><p>ativada pela adição de um nutriente específico no meio de cultura, possibilitando a observação de efeitos</p><p>celulares e moleculares na presença ou ausência de um gene em estudo.</p><p>Outra abordagem experimental atual é a cultura de células em três dimensões, em que as células se associam</p><p>entre si em vez de interagir apenas com o substrato, produzindo arranjos celulares denominados “esferoides”. Tal</p><p>estratégia mimetiza diferentes aspectos da formação de tecidos in vivo e torna possível analisar comunicação</p><p>celular, desenvolvimento de matriz extracelular, migração e diferenciação celulares.</p><p>Quando se generalizou o emprego de culturas de células para cultivar vírus, observou-se que alguns deles</p><p>tinham moléculas fusogênicas, com a propriedade de induzir as células a se fundirem, formando células dos tipos</p><p>binucleadas e multinucleadas (sincícios; Figura 3.28), mesmo quando se tratava de células de animais de</p><p>espécies diferentes. Formam-se assim células com cromossomos de espécies diferentes, denominadas</p><p>“heterocários”.</p><p>Figura 3.28 Alguns vírus apresentam em sua superfície proteínas que interagem com receptores</p><p>celulares, geralmente envolvidos na fusão do envelope viral com a membrana plasmática, porém, em</p><p>condições específicas essa interação pode induzir a fusão de células ou a formação de sincícios.</p><p>Os heterocários têm sido utilizados para o estudo da fisiologia do núcleo celular e, principalmente, dos</p><p>efeitos do citoplasma no núcleo.</p><p>O vírus Sendai, do grupo dos mixovírus, é o preferido para a obtenção de heterocários. Esse vírus, que causa</p><p>no homem uma doença parecida com a gripe, foi isolado pela primeira vez em Sendai, no Japão, por isso essa</p><p>designação. Os vírus inativados pela radiação ultravioleta não perdem a propriedade de promover a fusão das</p><p>células, sendo preferidos para se obter heterocários, pois assim não há proliferação viral, o que dificultaria a</p><p>observação dos fenômenos celulares.</p><p>Nos heterocários binucleados, os núcleos geralmente entram em mitose de modo sincrônico; mas, como se</p><p>forma um único fuso, o resultado são duas células-filhas, cada uma com um núcleo constituído por cromossomos</p><p>de ambos os núcleos iniciais do heterocário. Desse modo, formam-se células mononucleadas, mas que contêm</p><p>cromossomos de espécies animais diferentes. Essas células podem multiplicar-se numerosas vezes, embora</p><p>frequentemente ocorra a eliminação de algum cromossomo em cada divisão, havendo tendência para</p><p>permanecerem os cromossomos de uma espécie, enquanto os da outra vão sendo parcialmente eliminados.</p><p>As células podem ser submetidas a variadas técnicas de microcirurgia que utilizam instrumentos com</p><p>extremidades de dimensões microscópicas. Entre esses instrumentos, geralmente feitos de vidro, estão agulhas de</p><p>diferentes formatos, bisturis, pipetas e eletrodos. Por meio da microcirurgia, é possível proceder à determinação</p><p>do pH intracelular, ao deslocamento e à remoção de organelas e vesículas, ao transplante de partes de uma célula</p><p>para outra e à remoção, por seccionamento, de fragmentos celulares. A microcirurgia é realizada com aparelhos</p><p>especiais, denominados “micromanipuladores”, que proporcionam movimentos muito precisos e delicados.</p><p>Os diferentes tipos de cultura celular são essenciais em estudos farmacológicos e toxicológicos, e</p><p>possibilitam analisar múltiplos efeitos de substâncias nas células e seus perfis de expressão gênica. Muitas vezes</p><p>esses métodos são passíveis de automatização, criando estratégias de varredura por novos fármacos em ampla</p><p>escala.</p><p>Ensaios moleculares</p><p>Reação em cadeia da polimerase</p><p>Em meados dos anos 1980, foi desenvolvida a técnica de amplificação de segmentos de DNA, denominada</p><p>“reação em cadeia da polimerase” (PCR, do inglês polimerase chain reaction). Capaz de sintetizar</p><p>exponencialmente cópias de uma sequência específica – sequência-alvo –, revolucionou os estudos sobre</p><p>biologia molecular, facilitando experimentos de clonagem, sequenciamento, quantificação de DNA e RNA,</p><p>análises funcionais de genes, estudos de mutações sítio-dirigidas, entre outros.</p><p>Atualmente a metodologia baseia-se no uso de um meio reacional contendo uma enzima DNA polimerase</p><p>termoestável, oligonucleotídios com sequências complementares ao fragmento de DNA a ser amplificado</p><p>(também designados como primers), desoxirribonucleotídios (dATP, dTTP, dCTP e dGTP, ou dNTPs para</p><p>simplificar), cátions bivalentes em um tampão aquoso, além de uma concentração inicial da sequência-alvo</p><p>(usualmente muito diluída). Essa solução proporciona condições ideais para o funcionamento da enzima e</p><p>reagentes em abundância para sintetizar novas fitas de DNA.</p><p>Após o preparo da solução, é necessário alterar a temperatura do meio sequencialmente e de maneira cíclica,</p><p>de modo que o meio passe por três fases distintas: desnaturação, geralmente uma temperatura alta (≈ 95°C) que</p><p>proporcione a separação das fitas de DNA que serão copiadas; anelamento, temperatura em que os</p><p>oligonucleotídios associam-se às fitas-molde devido a sua complementaridade de sequência (≈ 55 a 65°C,</p><p>dependendo da sequência e do tamanho do primer); extensão, temperatura em que a maioria das enzimas</p><p>comerciais polimerizam novas fitas de DNA com máxima eficiência (72°C). Cada passo tem um tempo de</p><p>duração específico, em geral 10 a 30 segundos para desnaturação, 20 a 40 segundos para anelamento e 1</p><p>minuto/kpb a ser copiado para a extensão. A cada ciclo ocorre a duplicação da sequência contida entre as regiões</p><p>de hibridação dos oligonucleotídios (Figura 3.29), explicando o aumento exponencial de cópias; ao final dos</p><p>ciclos, o meio reacional terá 2n vezes mais trechos de DNA do que no início, onde n é o número de ciclos.</p><p>Inicialmente, os ciclos eram realizados inserindo-se os tubos com as reações em banhos ajustados em</p><p>temperaturas diferentes e cronometrando-se sua permanência em cada passo. Rapidamente esse processo foi</p><p>automatizado e surgiram várias soluções para realizar esses ciclos térmicos. Atualmente PCRs são realizadas em</p><p>termocicladores digitais, equipamentos dotados de um ou mais blocos térmicos que usam o fenômeno físico</p><p>denominado “efeito Peltier” para controlar a temperatura, aquecendo e refrigerando a reação de modo preciso e</p><p>rápido (Figura 3.30).</p><p>Os protocolos mais comuns tornam possível a amplificação de fragmentos de até ≈ 5.000 pares de bases,</p><p>outros mais elaborados e com o uso de reagentes específicos e misturas de enzimas modificadas permitem</p><p>amplificar até ≈ 45 kpb.</p><p>As sequências dos oligonucleotídios complementares às regiões, que flanqueiam o trecho de interesse a ser</p><p>amplificado, proporcionam a especificidade da reação. Assim, a região a ser amplificada não precisa ser</p><p>conhecida, mas aquelas onde serão sítios de anelamento aos primers precisam ter sua sequência definida.</p><p>Vários fatores podem influenciar a eficiência e a especificidade de uma reação de PCR, como: a sequência de</p><p>nucleotídios dos primers, a força iônica do meio reacional, a quantidade de bases C e G na região de interesse, a</p><p>temperatura de anelamento, uso de detergentes na reação. Esses fatores podem ser utilizados a favor, de modo</p><p>que se possa modular a estringência da reação. Uma reação muito estringente fornecerá produtos de PCR</p><p>específicos. Caso seja interessante identificar uma família de genes similares, a estringência pode ser diminuída e</p><p>serão produzidos produtos de PCR diferentes, contendo fragmentos de interesse e artefatos inespecíficos.</p><p>Atualmente, bancos de dados internacionais possuem sequências de genomas completos de diversos</p><p>organismos, permitindo o desenho informatizado de oligonucleotídios específicos, com chances mínimas de</p><p>anelarem em</p><p>regiões diferentes daquelas a que foram destinados. Também é possível desenhar um</p><p>oligonucleotídio aproximado para uma PCR em organismos ainda não sequenciados com base em genomas de</p><p>organismos evolutivamente próximos.</p><p>Figura 3.29 A. Fases de uma reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar até 2 kpb de</p><p>ácido desoxirribonucleico. B. Representação das cópias produzidas em três ciclos de uma PCR.</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>Figura 3.30 Termociclador moderno, equipamento utilizado para controlar os ciclos de temperatura</p><p>necessários para a realização da reação. Atualmente esses equipamentos são digitais, possibilitam</p><p>programações complexas, com variações a cada ciclo, e têm a capacidade de formar gradientes de</p><p>temperatura. (Imagem cedida por ThermoFischer®).</p><p>PCR na pesquisa</p><p>A técnica de PCR evoluiu muito desde seu desenvolvimento inicial, promovendo o surgimento de uma gama</p><p>abrangente de aplicações e técnicas derivadas que são empregadas atualmente em ampla escala em laboratórios</p><p>de pesquisa no mundo todo.</p><p>Exemplos de aplicações:</p><p>Transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR, do inglês reverse transcription</p><p>polymerase chain reaction): torna possível a amplificação de fragmentos de DNA complementar (cDNA) a</p><p>partir de RNA</p><p>PCR em tempo real: método quantitativo que determina quantidade de cópias de genes no genoma, níveis de</p><p>transcrição gênica, carga viral e perfis de transcrição ao longo do desenvolvimento</p><p>Rápida amplificação das extremidades de cDNA (RACE, do inglês rapid amplification of cDNA ends):</p><p>método de clonagem de regiões desconhecidas de mRNAs</p><p>Amplificação de genomas completos (WGA, do inglês whole genome amplification): método de</p><p>amplificação de genomas usado até mesmo a partir de uma única célula.</p><p>Uso clínico de PCR</p><p>A capacidade de produzir quantidades significativas de DNA a partir de vestígios de material</p><p>genético tornou a PCR uma ferramenta com importância muito além da pesquisa.</p><p>Atualmente estão disponíveis comercialmente kits com base em PCR para diagnósticos</p><p>variados e aplicações forenses, como em:</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>Detecção de mutações em oncogenes, identificando em estágios iniciais de muitos tipos</p><p>de câncer, possibilitando terapias personalizadas para cada paciente</p><p>Detecção de infecções virais e bacterianas</p><p>Identificação de portadores de marcadores genéticos para aconselhamento reprodutivo</p><p>ou exames pré-natais</p><p>Testes de paternidade.</p><p>Vetores</p><p>Vetores são ferramentas de Biologia Molecular muito versáteis para o estudo de células vivas. Realizam</p><p>transferências ou alterações de informação genética, proporcionando variadas análises mecanísticas.</p><p>Vetores são veículos de informação genética, usualmente uma sequência de DNA contendo um segmento de</p><p>interesse em nosso estudo (chamado “cassete” ou “inserto”) e outras regiões contendo genes e reguladores para a</p><p>manutenção, replicação e outros processos relacionados com o vetor e sua propagação. São replicados quando no</p><p>interior de uma célula (que pode ser procariota ou eucariota, dependendo do vetor) e de fácil isolamento a partir</p><p>de uma cultura. Conforme descrito a seguir, vetores podem ser virais, DNAs circulares ou cromossomos</p><p>artificiais. Dependendo da combinação de elementos regulatórios contidos nos vetores, direcionam a transcrição</p><p>do cassete. A expressão de um gene exógeno pode alterar o fenótipo celular e contribuir com o entendimento do</p><p>seu funcionamento.</p><p>Plasmídios representam um exemplo de vetor: são DNAs circulares de dupla-fita. Carregam um ou mais</p><p>genes de resistência a antibióticos ou outro fator ambiental que permita selecioná-los (p. ex., células contendo</p><p>plasmídio sobrevivem no meio de cultura em que há o antibiótico a que ele confere resistência; Figura 3.31).</p><p>Comumente, os plasmídios são mantidos e propagados em bactérias de laboratório. Para o estudo da biologia</p><p>celular de eucariotos, o plasmídio é extraído e purificado da bactéria e inserido nas células (ver boxe</p><p>Transformação e transfecção).</p><p>Outros tipos de vetores são: vírus (p. ex., bacteriófago λ), cromossomos artificiais (BAC – cromossomo</p><p>artificial de bactérias, YAC – cromossomo artificial de leveduras) e cosmídios (híbrido de plasmídio com</p><p>sequências de bacteriófago). Cada tipo de vetor apresenta vantagens e especificidade a tipos celulares.</p><p>É possível encontrar vetores disponíveis comercialmente, modificados artificialmente para desempenharem</p><p>variadas funções, viabilizando o estudo de genes e regiões reguladoras.</p><p>Figura 3.31 Exemplo de vetor plasmidial. Corresponde a um vetor de clonagem. Esse vetor possui</p><p>replicação autônoma na bactéria devido à sua origem de replicação; contém um gene de resistência</p><p>ao antibiótico, possibilitando a seleção das colônias de bactérias que contêm plasmídios (pelo uso de</p><p>antibiótico no meio de cultura); uma região com múltiplos sítios de restrição, facilitando a clonagem de</p><p>fragmentos clivados com enzimas de restrição; e um gene repórter em volta do sítio de clonagem.</p><p>Nesse exemplo, o gene LacZ expressa uma β-galactosidase que, na presença de um análogo de</p><p>lactose no meio (X-Gal), produz um composto azul, indicando que o plasmídio está sem o cassete de</p><p>interesse. Colônias brancas indicam que o gene LacZ foi alterado pela inserção do cassete, não</p><p>sendo expresso corretamente.</p><p>Transformação e transfecção</p><p>A inserção de material genético exógeno (p. ex., um vetor) em uma célula é denominado</p><p>“transformação”. A inserção de um vetor em bactérias intitula-se transformação bacteriana;</p><p>em células animais, o processo é conhecido como transfecção.</p><p>Existem diferentes metodologias para inserir um vetor em uma célula, resumidas na</p><p>Figura 3.32, mas quase sempre é um processo de baixa eficiência e bastante laborioso.</p><p>Em laboratórios de pesquisa, as técnicas de transformação bacteriana mais rotineiras são</p><p>por choque térmico e por eletroporação. Em ambos os casos, as bactérias precisam estar</p><p>“competentes” para a transformação, ou seja, aptas a receberem o vetor.</p><p>Bactérias competentes para choque térmico crescem em meio de cultura apropriados e</p><p>são incubadas com cloreto de cálcio a 4°C. Ao adicionar DNA plasmidial à solução e promover</p><p>o choque térmico incubando a mistura a 42°C por 2 minutos, várias células apresentarão</p><p>perturbações em suas membranas, o que desencadeará o surgimento de poros e lesões. Em</p><p>uma fração dessas células, o DNA atravessa a membrana por essas aberturas, e as células, ao</p><p>se recuperarem, manterão esse DNA em seu interior.</p><p>O método de eletroporação expõe as células a pulsos em um campo elétrico de alta</p><p>tensão, que provoca a abertura de poros em sua membrana, suficientemente grandes para a</p><p>passagem do DNA do vetor. A passagem do DNA pela membrana conta com um componente</p><p>eletroforético, resultante de sua migração no campo elétrico.</p><p>Células animais também podem ser transfectadas por eletroporação. Outros métodos de</p><p>transfecção destacam-se no uso de células mais complexas.</p><p>A lipofecção é um método eficiente e pode ser utilizado tanto in vitro como in vivo com</p><p>baixa toxicidade. O DNA do vetor é encapsulado em um lipossomo (vesícula delimitada por</p><p>bicamada lipídica); essas vesículas em contato com as células podem fundir suas membranas</p><p>ou a célula pode endocitá-las.</p><p>Vetores virais são bastante eficientes na entrega de material genético às células de</p><p>mamíferos. O uso desses vetores exige um complexo e elegante protocolo, em que dois</p><p>plasmídios são construídos: um contendo o DNA de interesse e sequências virais</p><p>responsáveis pelo encapsulamento desse DNA em uma partícula viral; e um segundo</p><p>plasmídio contendo os genes para produzir as partículas virais. Desse modo, nenhum dos</p><p>plasmídios é capaz de produzir um vírus completo, e as partículas virais produzidas só</p><p>carregam o DNA do plasmídio contendo o DNA a ser transferido e as sequências de</p><p>sinalização de empacotamento, não produzindo novas partículas virais. Após a transfecção</p><p>desses plasmídios em células produtoras, elas passam a produzir partículas virais capazes de</p><p>entrar em células específicas e entregar o seu material genético de maneira segura.</p><p>O reino Plantae inclui os vegetais superiores. O reino Animalia abrange todos os animais. B.</p><p>Classificação dos três domínios, conforme proposto por Woese na década de 1970, com base na</p><p>sequência de nucleotídios do ácido ribonucleico ribossomal (rRNA). Essa classificação separa</p><p>Eubacteria, Archaea e Eucarya. A diversificação do rRNA em animais, plantas e fungos é pequena,</p><p>como pode ser observado no quadrado em destaque no canto inferior dessa imagem. (B, adaptada</p><p>de Kolter e Maloy, 2012.)</p><p>Figura 1.2 A sequência de ácido desoxirribonucleico de um gene muito conservado (p. ex.,</p><p>codificando o ácido ribonucleico ribossomal) foi usada como relógio molecular para estimar o tempo</p><p>transcorrido desde o seu ancestral comum. Para esse gene, sabe-se que a taxa de alteração é de um</p><p>nucleotídio/25 milhões de anos (nucleotídios sombreados). Como as linhagens mais recentes diferem</p><p>em quatro nucleotídios, é possível inferir que seu ancestral comum viveu há pelo menos 50 milhões</p><p>de anos.</p><p>Essa classificação e as informações moleculares possibilitaram inferir que a célula ancestral universal seria</p><p>semelhante à da archaea (ver Figura 1.1). Uma das hipóteses é que o ancestral comum archaea teria ganho maior</p><p>complexidade e dado origem aos eucariontes. Ao mesmo tempo, alguns desses ancestrais teriam sofrido</p><p>modificações e gerado o domínio eubactéria. Outra hipótese é a de “termorredução” e considera que o ancestral</p><p>comum teria sido um eucarioto mesófilo, ou seja, que sobrevive em temperaturas moderadas (entre 20 e 45°C).</p><p>Esse eucarioto poderia ter sofrido modificações e dado origem a organismos termófilos, os quais podem</p><p>sobreviver em temperaturas extremas (até 75°C), como é o caso dos seres do domínio archaea. Essa hipótese</p><p>ajuda a explicar a origem da membrana plasmática observada nos domínios archaea e eucarya.</p><p>Evolução das células</p><p>O processo evolutivo que originou as primeiras células na Terra começou há, aproximadamente, 4 bilhões de</p><p>anos. Naquela época, a atmosfera provavelmente continha vapor d’água, amônia, metano, hidrogênio, sulfeto de</p><p>hidrogênio e gás carbônico. O oxigênio livre só apareceu muito tempo depois, devido à atividade fotossintética</p><p>das células autotróficas. Uma das hipóteses para origem das células é a grande quantidade de água, distribuída</p><p>em grandes oceanos e lagoas, que cobria a superfície da Terra há 4 bilhões de anos. Essa massa líquida,</p><p>denominada “caldo primordial”, era rica em moléculas inorgânicas e continha em solução os gases que</p><p>constituíam a atmosfera daquela época. Sob a ação do calor e da radiação ultravioleta, vindos do Sol, e de</p><p>descargas elétricas, oriundas das tempestades que eram muito frequentes, as moléculas dissolvidas no caldo</p><p>primordial combinaram-se quimicamente para constituírem os primeiros compostos contendo carbono.</p><p>Substâncias relativamente complexas como proteínas e ácidos nucleicos, que, nas condições terrestres atuais só</p><p>se formam pela ação das células, teriam aparecido nessa mistura. As diferentes hipóteses para a origem da vida</p><p>na Terra, entretanto, ainda são tema de debate na comunidade científica. Muitos pesquisadores argumentam que a</p><p>síntese de compostos orgânicos não poderia ter ocorrido em oceanos, onde esses elementos estariam mais</p><p>dispersos e em menor concentração. Ao contrário, os compostos inorgânicos utilizados como “matéria-prima”</p><p>•</p><p>•</p><p>•</p><p>deveriam estar mais concentrados, em menor quantidade de água, e possivelmente estariam sujeitos a ciclos de</p><p>ressecamento sob o Sol, para possibilitar a formação desses complexos orgânicos que originariam as células.</p><p>Tendo ocorrido no caldo primordial ou em pequenas lagoas, esse tipo de fusão de compostos orgânicos é</p><p>denominado síntese prebiótica. Esta originou-se sem a participação de seres vivos, a partir de compostos</p><p>inorgânicos, e já foi demonstrada experimentalmente (Figura 1.3).</p><p>A síntese prebiótica propiciou o acúmulo gradual dos compostos de carbono na Terra, o que foi favorecido</p><p>por três circunstâncias:</p><p>A enorme extensão desse planeta, com grande variedade de nichos, onde provavelmente ocorreu a formação</p><p>de moléculas que foram mantidas próximas umas das outras e, certamente, diferentes das existentes em</p><p>outros locais</p><p>O longo tempo, já que a síntese prebiótica ocorreu por cerca de 2 bilhões de anos</p><p>A ausência de oxigênio na atmosfera, o que teria impedido que as moléculas recém-formadas fossem</p><p>destruídas por oxidação. Na atmosfera atual da Terra, a síntese prebiótica seria impossível.</p><p>É provável que nesse ambiente tenham surgido os primeiros polímeros de aminoácidos e de nucleotídios,</p><p>formando-se assim as primeiras moléculas de proteínas e de ácidos nucleicos. A teoria metabólica considera que</p><p>o aparecimento das proteínas que funcionariam como enzimas, importantes para o metabolismo, teriam dado</p><p>origem às células; no entanto, proteínas não podem se autorreplicar, o que torna essa hipótese menos provável.</p><p>Uma outra teoria defende que o surgimento das bicamadas lipídicas e das membranas biológicas tenha sido o</p><p>ponto de partida para a formação de células, entretanto apenas os ácidos nucleicos realizam autoduplicação. A</p><p>hipótese do RNA world baseia-se na premissa de que o próprio RNA catalisaria sua duplicação, sem a</p><p>necessidade de proteínas (enzimas) ou outras moléculas. Essa teoria foi fortalecida com a descoberta de que</p><p>RNAs da bactéria E. coli têm atividade enzimática sobre RNAs transportadores (tRNAs) e de que alguns rRNAs</p><p>podem sofrer autossplicing. O processo de splicing consiste na remoção de sequências denominadas “íntrons” e</p><p>na reunião dos éxons em RNAs precursores de eucariotos. No caso do autossplicing, a própria molécula de RNA</p><p>seria capaz de clivar e remover trechos de nucleotídios de sua própria sequência, sem a necessidade de enzimas</p><p>de natureza proteica para catalisar esse processo. Essa observação indica que esses RNAs apresentam atividade</p><p>similar à de uma enzima, funcionando como “ribozimas”. Essa hipótese foi formalizada por Walter Gilbert, em</p><p>1986, mas já era discutida desde a década de 1960, com trabalhos do biofísico Alexander Rich.</p><p>Figura 1.3 Aparelho criado por Stanley L. Miller para demonstrar a síntese de moléculas orgânicas</p><p>sem a participação de seres vivos (síntese prebiótica), nas condições da atmosfera terrestre. O</p><p>aparelho continha vapor d’água, proveniente do aquecimento do balão inferior. Pela torneira do lado</p><p>esquerdo foram introduzidos metano, amônia, hidrogênio e gás carbônico, que, ao passarem pelo</p><p>balão superior direito, eram submetidos a centelhas elétricas. Essa mistura tornava-se líquida no</p><p>condensador e era recolhida pela torneira inferior. Observou-se que esse líquido continha diferentes</p><p>moléculas de compostos de carbono (orgânicas), inclusive aminoácidos.</p><p>O fato é que, ao surgirem as primeiras moléculas de ácidos nucleicos com capacidade de se duplicarem,</p><p>estava iniciado o caminho para a formação das primeiras células. Um sistema formado por ácidos nucleicos com</p><p>atividade autocatalítica, ou seja, que possibilitasse a replicação de ácidos nucleicos, capazes de armazenar o</p><p>material genético, deveria permanecer isolado para que as moléculas não se dispersassem no líquido prebiótico.</p><p>Para que os ácidos nucleicos pudessem se replicar e formar proteínas, os componentes dessas reações</p><p>precisariam estar concentrados e próximos, para que essas transformações acontecessem com maior facilidade e</p><p>eficiência. A formação de moléculas de fosfolipídios que espontaneamente constituíram as primeiras bicamadas</p><p>fosfolipídicas permitiu o agrupamento de moléculas de ácidos ribonucleicos, nucleotídios, proteínas e outras</p><p>moléculas. Estava, assim, constituída a primeira célula, envolta por uma membrana fosfolipídica. Os</p><p>fosfolipídios são moléculas alongadas, com uma cabeça hidrofílica e duas cadeias hidrofóbicas. Quando estão</p><p>dissolvidas em água, as moléculas de fosfolipídios associam-se por interação hidrofóbica de suas cadeias</p><p>hidrocarbonadas e constituem bicamadas espontaneamente, sem necessidade de energia (ver Capítulo 4).</p><p>Os dados hoje disponíveis tornam possível supor</p><p>Figura 3.32 Exemplos de diferentes metodologias para transferência de material genético para o</p><p>interior de células de procariotos e eucariotos. (Adaptada de ThermoFischer®:</p><p>https://www.thermofisher.com/br/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-</p><p>basics/gene-delivery-technologies/cationic-lipid-mediated-delivery/how-cationic-lipid-mediated-</p><p>transfection-works.html.)</p><p>https://www.thermofisher.com/br/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/gene-delivery-technologies/cationic-lipid-mediated-delivery/how-cationic-lipid-mediated-transfection-works.html</p><p>Edição gênica como ferramenta de estudos</p><p>Desde a descrição da estrutura do DNA, várias técnicas de manipulação de ácidos nucleicos foram</p><p>desenvolvidas. Modificar o conteúdo genético de células vivas costuma ser um processo lento e complexo, com</p><p>rendimento baixo e alto custo, exigindo uma grande quantidade de células no início do processo e maneiras de</p><p>identificar a pequena parcela de células que foram modificadas ao final.</p><p>Atualmente existem metodologias para interferir em diferentes níveis do fluxo de informações genéticas,</p><p>podendo atuar no genoma ou no transcriptoma (conjunto de RNAs transcritos em um determinado tipo celular</p><p>em um momento do desenvolvimento). Além de numerosas aplicações práticas, esses métodos possibilitam</p><p>estudos funcionais, ou seja, identificar efeitos e mecanismos relacionados com um gene de interesse após a sua</p><p>superexpressão, subexpressão e/ou deleção (knock out).</p><p>Em vez de descrever várias metodologias de manipulação gênica, será abordada uma tecnologia que tem se</p><p>mostrado bastante versátil e de desenvolvimento rápido: CRISPR.</p><p>O acrônimo CRISPR (do inglês clustered regularly interspaced short palindromic repeat), que define o nome</p><p>da técnica de manipulação genômica descrita a seguir, refere-se a sequências de DNA denominadas “repetições</p><p>palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas”. Essas sequências foram identificadas em</p><p>genomas de procariotos e representam parte de um mecanismo adaptativo de defesa contra infecções virais</p><p>desses organismos, com base na ação da nuclease Cas.</p><p>O primeiro sistema CRISPR a ser aplicado para edição genômica de células eucarióticas foi com a</p><p>endonuclease Cas9. Resumidamente, a endonuclease Cas9 utiliza uma sequência de RNA (crRNA; CRISPR</p><p>RNA), para guiá-lo à sequência-alvo no genoma. O crRNA tem 20 nucleotídios, é complementar à sequêcia-alvo</p><p>e confere especificidade à ação de Cas9. A endonuclease Cas9 forma um complexo com o crRNA e um outro</p><p>RNA estrutural (tracrRNA; transactivating crRNA) que provê estabilidade ao complexo Cas9-gRNA (Figura</p><p>3.33). Devido ao seu papel estrutural, a sequência do tracrRNA é constante. A sequência do crRNA é desenhada</p><p>pelo pesquisador para o gene-alvo de interesse. Esse complexo cliva o DNA genômico próximo à região</p><p>complementar ao crRNA. A quebra em dupla-fita do DNA genômico abre espaço para passos posteriores de</p><p>edição genômica. Na prática, a sequência do crRNA e do tracrRNA são conjugados em sequência única</p><p>conhecida como gRNA (guide RNA). O conjunto Cas9-gRNA é o cerne do sistema CRISPR de edição.</p><p>Na prática, é possível utilizar um plasmídio contendo a sequência para o RNA-guia artificial, uma proteína</p><p>Cas (usualmente Cas9) e outros elementos de controle. Caso necessário, uma região contendo a sequência que</p><p>será inserida no reparo guiado por homologia pode estar presente. Após a transfecção, o plasmídio contendo os</p><p>elementos CRISPR transcreve o RNA-guia e o mRNA de Cas, o complexo é formado e tem início o processo de</p><p>edição.</p><p>Com o avanço das pesquisas sobre o sistema CRISPR/Cas, diferentes variações surgiram, com a vantagem de</p><p>serem programáveis, específicas e de fácil manejo (em relação a outros métodos).</p><p>Assim, sistemas modificados CRISPR/Cas podem provocar quebras em dupla-fita ou em apenas uma fita de</p><p>DNA. E, aproveitando-se de mecanismos de reparo de DNA em eucariotos, é possível direcionar mutações</p><p>pontuais nessas quebras de fita simples ou inserir/remover trechos de DNA (Figura 3.34).</p><p>Além de editar genomas, essa tecnologia já foi modificada para aplicações variadas como modular expressão</p><p>gênica, modificar padrões de metilação de cromatina, servir de marcador em sistemas de imagem de cromatina,</p><p>entre outras.</p><p>Figura 3.33 A nuclease Cas9 utiliza uma sequência de RNA (chamada “gRNA”) para identificar o</p><p>local a ser editado. O gRNA é uma sequência artificial que contém duas partes: um crRNA de 20</p><p>nucleotídios (em amarelo) e um tracrRNA, com função estrutural (em azul). O tamanho de 20</p><p>nucleotídios é suficiente para conferir especifidade probabilística. O genoma humano tem 3,0 × 109 bp</p><p>e a probabilidade de ocorrer 1 de uma sequência específica de 20 bp é de 1 em 1012. Contudo, o</p><p>sistema não é totalmente fidedigno, e podem ocorrer erros de edição, alterando regiões fora do</p><p>desejado que tenha pareamento parcial do crRNA. O sítio PAM (do inglês protospacer adjacent motif)</p><p>corresponde a uma restrição desse sitema: o sítio-alvo deve estar próximo a um sítio NGG (em que N</p><p>é qualquer nucleotídio) no genoma.</p><p>Figura 3.34 Possíveis edições com o sistema CRISPR artificial. O sistema endógeno de reparo de</p><p>quebra de dupla-fita de DNA após a ação de CRISPR/Cas9 pode seguir dois caminhos: a via não</p><p>homóloga e a via homóloga. A via não homóloga (A) envolve a inserção ou remoção inacurada de</p><p>nucleotídios para emendar as extremidades soltas de DNA. Como a identidade e a quantidade de</p><p>nucleotídios inseridos ou removidos são aleatórias, esses mecanismos causam deleção parcial ou</p><p>mudança do quadro de leitura de genes codificantes (indel). A de via de reparo por homologia (B)</p><p>depende de um DNA-molde homólogo que age como doador de sequência por recombinação. Esse</p><p>cenário tem uma probabilidade bem menor de ocorrer, porque depende da ativação de mecanismos</p><p>de recombinação. As edições genéticas que utilizam essa via visam à inserção precisa e definida de</p><p>sequências exógenas.</p><p>Bibliografia</p><p>Allen RD. New observations on cell architecture and dynamics by videoenhanced contrast optical microscopy. Ann Rev Biophys</p><p>Chem. 1985;14:265.</p><p>Baker JRL. Autoradiography: A Comprehensive Overview. New York: Oxford University Press; 1989.</p><p>Bendayan M. Protein A-gold electron microscopic immunocytochemistry: Methods, applications and limitations. J Electron Microsc</p><p>Techn. 1984;1:243.</p><p>Bozzola JJ, Russell LD. Electron Microscopy. Principles and Techniques for Biologists. Boston: Jones and Bartlett Publishers; 1992.</p><p>Campbell MK, Farrell SO. Biochemistry. 6th ed. 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New York: Pergamon Press; 1981.</p><p>Introdução</p><p>Composição das membranas celulares: estrutura lipoproteica</p><p>Importância do revestimento de carboidratos na membrana plasmática</p><p>Membranas celulares são assimétricas e apresentam domínios específicos</p><p>Permeabilidade seletiva das membranas celulares</p><p>Especializações de membranas plasmáticas: microvilos e estereocílios</p><p>Reconhecimento, adesão e junção entre células</p><p>Síntese e reciclagem de membranas celulares</p><p>Bibliografia</p><p>Introdução</p><p>As membranas celulares são as estruturas que dividem fisicamente os compartimentos da célula e atuam no</p><p>controle de saída e entrada de diferentes substâncias nesses compartimentos. Dentre as membranas celulares,</p><p>pode-se destacar a membrana plasmática, responsável pela separação entre os meios intracelular e extracelular,</p><p>crucial para a existência da célula.</p><p>Por apresentarem espessura de aproximadamente 5 nm, as membranas celulares só podem ser observadas por</p><p>microscopia eletrônica, porém a existência de uma barreira “invisível” que separava o meio externo do interno</p><p>das células – a membrana plasmática – já era inferida por observações experimentais mesmo antes do</p><p>desenvolvimento de microscópios eletrônicos. A constatação de que o volume da célula se altera, dependendo</p><p>das concentrações das soluções que entram nela (Figura 4.1), foi um dos primeiros indícios da existência e da</p><p>seletividade dessa membrana.</p><p>Diferentemente dos procariotos, as células eucarióticas dispõem de um elaborado sistema de membranas</p><p>intracelulares que cria ambientes com características próprias (pH, concentração de solutos e tipos de proteínas),</p><p>como mitocôndrias (ver Capítulo 5), envelope nuclear (ver Capítulo 9), lisossomos (ver Capítulo 13), retículo</p><p>endoplasmático, complexo de Golgi (ver Capítulo 14) e cloroplastos. Essa subdivisão proporcionada pelas</p><p>membranas intracelulares cria ambientes com características bioquímicas específicas, capazes de realizar funções</p><p>especializadas com maior eficiência. Esse fato tem grande importância para a evolução desses organismos, como</p><p>visto no Capítulo 1.</p><p>A manutenção do ambiente em cada organela e no próprio citoplasma depende de proteínas especializadas da</p><p>membrana que regulam a passagem seletiva de solutos. Essa regulação é importante para produzir, por exemplo,</p><p>o gradiente de íons necessário para a síntese de trifosfato de adenosina (ATP) e a transmissão de sinais elétricos,</p><p>como em células nervosas ou musculares.</p><p>Apesar dessa compartimentalização, as estruturas delimitadas por membranas devem interagir com o</p><p>ambiente em que se encontram e adaptar-se a alterações intra e extracelulares. Dessa maneira, as membranas</p><p>reconhecem e processam diferentes tipos de informações (ver Capítulo 6). A membrana plasmática, por exemplo,</p><p>contém diferentes proteínas em sua estrutura que agem como sensores de sinais externos (receptores), que</p><p>reconhecem ligantes específicos, presentes na membrana plasmática de outras células, ou diferentes tipos de</p><p>moléculas circulantes, como hormônios. Esse reconhecimento – a ligação de uma molécula específica com o</p><p>receptor de membrana – desencadeia respostas que variam conforme a célula e o estímulo recebido. Essa reação</p><p>pode ser contração ou movimento celular, inibição ou estímulo da secreção, síntese de anticorpos, proliferação</p><p>mitótica, entre outras. Do mesmo modo, as membranas das organelas respondem a sinais intracelulares por meio</p><p>de proteínas sensores em suas membranas. Um exemplo disso são os receptores para complexos ribossomais, que</p><p>traduzem proteínas endereçadas ao retículo endoplasmático (RE), localizadas em sua membrana (ver Capítulo</p><p>14).</p><p>As membranas têm também importante função estrutural, a interação de proteínas das membranas</p><p>intracelulares e da membrana plasmática com o citoesqueleto, por exemplo, mantém uma distribuição organizada</p><p>das organelas no citoplasma. Em organismos pluricelulares, a ligação ou o ancoramento de proteínas da</p><p>membrana plasmática com a matriz extracelular ou com a membrana de outras células é importante para a</p><p>estrutura de tecidos e órgãos. Assim, as membranas plasmáticas contêm moléculas que participam da fixação da</p><p>célula em determinados locais (ligações estáveis) e também auxiliam na migração celular (ligações instáveis)</p><p>(ver Capítulos 7 e 8).</p><p>Figura 4.1 Modificações do volume celular conforme a concentração do meio externo. Parte superior:</p><p>mudanças de volume de uma célula vegetal durante a variação de solutos no meio. À esquerda, em</p><p>meio normal (meio isotônico), a célula preenche todo o espaço delimitado pela parede vegetal externa</p><p>a ela. Em meio hipertônico, a célula perde líquido para o meio, reduz seu volume, sofre plasmólise e,</p><p>posteriormente, plasmólise avançada. Quando a célula plasmolisada volta ao meio hipotônico, ela</p><p>retorna ao seu volume original. Esse retorno é conhecido como desplasmólise. Parte inferior:</p><p>eritrócitos (hemácia) em meio hipertônico (NaCl a 1,5%, perde líquido para o meio), em meio isotônico</p><p>(NaCl a 0,9%, mantém o volume celular), em meio hipotônico (NaCl a 0,6 e 0,4% a célula incha). Em</p><p>meio fortemente hipotônico, a membrana plasmática do eritrócito se rompe, processo conhecido como</p><p>hemólise. Em células vegetais, a parede celular impede o rompimento dessa membrana.</p><p>Além disso, as membranas plasmáticas de células justapostas, ancoradas firmemente entre si, formam</p><p>barreiras que podem delimitar diferentes compartimentos. Um exemplo é a camada de células epiteliais que</p><p>reveste internamente o sistema digestório e constitui uma barreira com permeabilidade seletiva. Essa barreira</p><p>separa os meios externo (conteúdo do sistema digestório) e interno (sangue, linfa, matriz extracelular dos</p><p>tecidos). As membranas dessas células justapostas podem estabelecer canais de comunicação entre si, por onde</p><p>ocorrem trocas de moléculas e íons que participam da coordenação das atividades desses agrupamentos celulares.</p><p>Apesar das distintas funções exercidas nos diferentes tipos celulares e compartimentos, todas as membranas</p><p>celulares têm uma estrutura geral comum, constituída de uma bicamada lipídica e proteínas (Figura 4.2). A</p><p>bicamada lipídica forma uma barreira relativamente impermeável a diferentes moléculas hidrossolúveis, e as</p><p>proteínas são, na sua maioria, as moléculas que medeiam as funções da membrana já descritas. Além disso,</p><p>muitos sistemas enzimáticos encontram-se presos às membranas, o que possibilita uma ordenação sequencial da</p><p>atividade de cada enzima, aumentando a eficiência desses sistemas. Desse modo, o produto de uma enzima é</p><p>processado pela enzima seguinte, assim sucessivamente, até a obtenção do produto final da cadeia enzimática.</p><p>Um exemplo é a cadeia transportadora de elétrons, cujos componentes (enzimas e transportadores) estão</p><p>localizados na membrana interna das mitocôndrias (ver Capítulo 5) e na face interna da membrana celular das</p><p>bactérias.</p><p>Apesar dessa estrutura geral comum de lipídios e proteínas, a proporção entre esses componentes varia</p><p>conforme sua função. Por exemplo, as membranas de mielina que recobrem as fibras nervosas e têm o papel de</p><p>isolante elétrico contêm 80% de lipídios, e as membranas mitocondriais internas contêm apenas 25% de lipídios,</p><p>apresentando uma predominância de proteínas responsáveis por</p><p>sua função enzimática, discutida anteriormente.</p><p>Composição das membranas celulares: estrutura lipoproteica</p><p>Todas as membranas celulares apresentam a mesma constituição básica: lipídios e proteínas. Os lipídios</p><p>apresentam duas camadas – a bicamada lipídica –, que forma uma barreira para a passagem da maioria das</p><p>moléculas solúveis em água, propriedade importantíssima para a função da membrana de manter os diferentes</p><p>compartimentos.</p><p>As proteínas estão inseridas na bicamada lipídica e são responsáveis por boa parte das funções específicas</p><p>das diferentes membranas. Essa configuração básica é mantida por interações não covalentes entre lipídios e</p><p>proteínas, permitindo que essas moléculas tenham liberdade de movimento (fluidez). Por isso a estrutura das</p><p>membranas celulares é também descrita como um mosaico (formada por diferentes moléculas) fluido.</p><p>Uma terceira classe de moléculas em membranas celulares são os carboidratos, os quais têm importante</p><p>função na membrana plasmática, pois constituem as glicoproteínas e os glicolipídios. A porção glicídica dessas</p><p>moléculas confere identidade e proteção à superfície externa da membrana plasmática (ver Figura 4.2).</p><p>Figura 4.2 Membrana plasmática de célula animal. As membranas celulares são constituídas por</p><p>duas camadas de lípídios (bicamada lipídica), com cadeias apolares (hidrofóbicas, em laranja)</p><p>voltadas para o interior e as extremidades polares (hidrofílicas, em azul) direcionadas para o exterior.</p><p>As proteínas integrais da membrana (em rosa) estão inseridas entre os lipídios, com as porções</p><p>hidrofóbicas interagindo com o interior da bicamada lipídica e as porções hidrofílicas com a camada</p><p>externa. Essas proteínas podem atravessar toda a espessura da membrana (denominada proteína</p><p>transmembranar) ou parcialmente. Proteínas de membrana que não se inserem na bicamada</p><p>lipídica, interagindo somente com as proteínas integrais (por ligações não covalentes), são intituladas</p><p>proteínas periféricas (em verde). Glicoproteínas e glicolipídios têm seus carboidratos direcionados</p><p>para o meio extracelular. A interação dessas proteínas de membrana no lado intracelular com o</p><p>citoesqueleto (microtúbulos e filamentos de actina) é também mostrada na figura.</p><p>Bicamada lipídica</p><p>Três tipos de lipídios compõem a bicamada de membranas celulares: fosfolipídios, glicolipídios e colesterol.</p><p>Todas essas macromoléculas são anfipáticas, isto é, apresentam uma região polar ou hidrofílica, solúvel em</p><p>meio aquoso, e uma região apolar ou hidrofóbica, insolúvel em água (ver Capítulo 2). Em ambientes aquosos, as</p><p>moléculas da bicamada lipídica estão organizadas com suas cadeias apolares (hidrofóbicas) voltadas para o</p><p>interior da membrana (protegidas da interação com a água), e as cabeças polares (hidrofílicas) direcionadas para</p><p>o meio aquoso. Essas duas camadas lipídicas associam-se pela interação hidrofóbica de suas cadeias apolares</p><p>(ver Figura 4.2).</p><p>Os fosfolipídios são os lipídios mais abundantes das membranas celulares, apresentando uma região</p><p>hidrofílica ligada a duas cadeias (caudas) hidrofóbicas de hidrocarbonetos (ver Capítulo 2), que variam em</p><p>tamanho (de 14 a 24 átomos de carbono) e pela presença ou ausência de ligações duplas (insaturações) entre</p><p>carbonos adjacentes da cadeia.</p><p>As duas cadeias de hidrocarbonetos nos fosfolipídios das membranas celulares são fundamentais para a</p><p>existência da bicamada lipídica. Em solução aquosa esses lipídios adquirem forma molecular cilíndrica e</p><p>agregam-se espontaneamente. Dessa maneira, a região hidrofóbica fica livre da interação com moléculas de água,</p><p>e a sua região hidrofílica fica exposta. Lipídios que apresentam somente uma cadeia de hidrocarbonetos têm</p><p>forma molecular cônica e formam preferencialmente uma estrutura esférica denominada “micela”. Nas micelas,</p><p>as cadeias de hidrocarbonetos também ficam protegidas das moléculas de água (ver Figura 2.21). Devido ao</p><p>formato molecular cilíndrico desses fosfolipídios com duas cadeias de hidrocarbonetos, em condições</p><p>fisiológicas (pH, temperatura, força iônica) a bicamada é o arranjo energeticamente mais favorável do que a</p><p>micela (ver Figura 2.21). Nessa bicamada lipídica, a única forma de evitar que suas extremidades hidrofóbicas se</p><p>exponham ao meio aquoso é a formação de uma esfera completa (ver Figura 2.21), resultando em um</p><p>compartimento fechado envolto por membrana. Essa é a característica primordial que possibilitou o surgimento</p><p>das células e a existência da vida como se conhece. Essa característica também é responsável pela capacidade de</p><p>as membranas de fecharem pequenas rupturas rapidamente (capacidade autosselante) pelo rearranjo de suas</p><p>moléculas, a fim de evitar a exposição de regiões hidrofóbicas ao meio aquoso. Grandes rupturas na membrana</p><p>são fechadas com auxílio da inserção de vesículas intracelulares (ver Capítulo 15).</p><p>Outro constituinte importante das membranas celulares são os glicolipídios, designação genérica para todos</p><p>os lipídios que contêm carboidratos, com ou sem radicais fosfato. Alguns podem apresentar resíduos de ácido</p><p>siálico, o que confere caráter negativo à sua região hidrofílica. Os glicolipídios mais abundantes em células</p><p>animais são os glicoesfingolipídios, que compõem muitos receptores das superfícies celulares.</p><p>As membranas das células animais contêm ainda o colesterol, o qual não está presente em células vegetais,</p><p>que apresentam outros esteróis em suas membranas. O colesterol contém um único grupo hidroxila (hidrofílico)</p><p>ligado a uma estrutura rígida em anel, seguida por uma pequena cadeia apolar de hidrocarbonetos (ver Capítulo</p><p>2).</p><p>A fluidez da bicamada lipídica depende de sua composição</p><p>Para exercer suas funções e promover certas reações nas células, as moléculas da membrana não podem estar</p><p>completamente paradas (estado cristalino rígido). Assim, a fluidez da membrana celular é importante para sua</p><p>função e está relacionada com a capacidade de suas moléculas se deslocarem no seu plano. Sabe-se que os</p><p>lipídios de membrana apresentam diferentes movimentos espontâneos, como rotação em seu eixo, deslocamento</p><p>lateral e, muito raramente, mudam de camada (conhecido como flip-flop), como mostrado na Figura 4.3. Essa</p><p>movimentação é influenciada pela temperatura e pelo tipo de ligação entre as moléculas. Quanto mais elevada a</p><p>temperatura, maior será a movimentação dessas moléculas (Figura 4.4); e quanto mais forte as interações entre as</p><p>moléculas lipídicas, menor é sua movimentação no plano da bicamada. Como essas interações dependem da</p><p>natureza química dessas moléculas, os tipos de fosfolipídios que estão presentes nessa membrana têm grande</p><p>influência em sua fluidez.</p><p>Enquanto fosfolipídios de cadeias mais longas proporcionam uma melhor interação das cadeias de</p><p>hidrocarbonetos das duas camadas lipídicas, diminuindo a fluidez dessas moléculas, fosfolipídios de cadeias</p><p>mais curtas promovem menor interação e, consequentemente, maior fluidez. De maneira semelhante,</p><p>fosfolipídios com cadeias de hidrocarbonetos saturadas, que apresentam uma configuração mais estendida (ver</p><p>Figura 4.4), propiciam melhor interação entre fosfolipídios adjacentes, diminuindo sua fluidez; e aqueles com</p><p>ligações insaturadas (duplas entre carbonos das cadeias de hidrocarbonetos) sofrem pequenas dobras nessas</p><p>cadeias, o que dificulta a interação entre os fosfolipídios, aumentando a fluidez da membrana (ver Figura 4.4).</p><p>Figura 4.3 Movimentos espontâneos dos fosfolipídios na bicamada lipídica. Os fosfolipídios</p><p>comumente se deslocam lateralmente no plano da bicamada lipídica (lateral), giram em torno do seu</p><p>próprio eixo (rotação) e contraem suas cadeias de hidrocarbonetos (flexão). Um quarto movimento é a</p><p>passagem de um fosfolipídio de uma face da camada lipídica para a outra (flip-flop). Este é um evento</p><p>que é mais raro, comparado aos já descritos, devido às forças hidrofóbicas nessa bicamada.</p><p>Proteínas específicas são responsáveis pela translocação de fosfolipídios de uma camada para outra.</p><p>Essa atividade é necessária para o crescimento proporcional das duas faces das membranas, assim</p><p>como para</p><p>manutenção de sua assimetria.</p><p>Figura 4.4 Modulação da fluidez da bicamada lipídica. A. O aumento da temperatura amplia a</p><p>velocidade de movimentação das moléculas da membrana, aumentando sua fluidez. B. Cadeias</p><p>saturadas de fosfolipídios interagem mais entre si e produzem membranas com menor fluidez (à</p><p>esquerda). Cadeias insaturadas (com duplas ligações entre carbonos) dificultam essa interação,</p><p>produzindo membranas mais fluidas (à direita). Note que a espessura das membranas que</p><p>apresentam mais fosfolipídios insaturados também é menor.</p><p>Influência da temperatura na composição da bicamada lipídica</p><p>Organismos como bactérias e leveduras, que conseguem se adaptar a mudanças de</p><p>temperatura, modificam a composição fosfolipídica de suas membranas de acordo com a</p><p>temperatura, para manutenção da fluidez. Em temperaturas mais baixas, há aumento de</p><p>fosfolipídios com cadeias mais curtas e mais insaturadas, elevando a fluidez da membrana.</p><p>Em temperaturas mais altas, predominam fosfolipídios com cadeias mais longas e com</p><p>poucas ligações duplas, diminuindo sua fluidez.</p><p>Influência da interação entre fosfolipídios para fluidez da membrana</p><p>Quanto mais ácidos graxos de cadeia saturada em membranas celulares, maior será a</p><p>interação dessas moléculas e, consequentemente, menor a sua fluidez. Isso é ilustrado em</p><p>produtos alimentícios compostos de ácidos graxos no nosso cotidiano. Por exemplo, o</p><p>enriquecimento de ácidos graxos com cadeias de hidrocarboneto insaturadas em óleos</p><p>vegetais mantém o estado líquido dessa gordura em temperatura ambiente. Já a manteiga,</p><p>que apresenta uma proporção maior de ácidos graxos com cadeias saturadas, apresenta-se</p><p>em estado mais sólido nessa mesma temperatura.</p><p>O colesterol, que compõe as membranas de células animais, também influencia a fluidez da membrana,</p><p>funcionando como um modulador desse mecanismo em resposta à temperatura. O colesterol se insere entre os</p><p>fosfolipídios, entre as caudas insaturadas (Figura 4.5). Essa interação faz com que em temperaturas altas ele</p><p>mantenha essas moléculas unidas, deixando-as menos fluidas. Já em baixa temperatura, ele previne uma maior</p><p>interação entre os fosfolipídios, aumentando a fluidez da membrana. O colesterol é estruturalmente uma</p><p>molécula rígida, sua presença torna as membranas menos deformáveis e permeáveis. As membranas das células</p><p>procariontes não contêm esteróis, salvo raras exceções.</p><p>Figura 4.5 O colesterol na bicamada lipídica. A hidroxila do colesterol (em vermelho) interage com a</p><p>cabeça hidrofílica dos fosfolipídios de membrana, enquanto a região em anel rígida e sua cauda de</p><p>hidrocarbonetos se inserem entre cadeias de hidrocarbonetos de dois fosfolipídios, preenchendo esse</p><p>espaço e diminuindo a mobilidade dessas moléculas.</p><p>Proteínas das membranas celulares</p><p>As proteínas de membrana, exceto quando associadas ao citoesqueleto, deslocam-se com facilidade no plano da</p><p>membrana, comprovando que esta é uma estrutura que possibilita a movimentação de proteínas dentro de uma</p><p>matriz lipídica líquida.</p><p>Proteínas se movem na bicamada lipídica</p><p>Um dos primeiros experimentos a demonstrar a movimentação das proteínas na membrana</p><p>foi realizado em 1970. Observou-se que, após a fusão de células humanas com as de</p><p>camundongos (induzida pelo vírus Sendai), as proteínas da membrana humana deslocavam-</p><p>se rapidamente, misturando-se com as da célula de camundongo. Essas últimas também se</p><p>deslocavam, porém com menor velocidade, pois são proteínas maiores.</p><p>Outro experimento clássico que demonstra a fluidez da membrana foi realizado com</p><p>lectinas. Lectinas são proteínas que se ligam a carboidratos específicos, podendo</p><p>eventualmente causar aglutinação de células, razão pela qual eram denominadas</p><p>“aglutininas”. Lectinas têm um papel importante em processos de reconhecimento celular,</p><p>tanto entre células de um mesmo organismo, como no reconhecimento e na ligação de vírus,</p><p>bactérias e fungos aos seus alvos. Devido a sua grande seletividade, elas são muito utilizadas</p><p>em estudos de Biologia Celular, como os que visam analisar a composição química dos</p><p>carboidratos das glicoproteínas e glicolipídios presentes na face externa da membrana</p><p>plasmática.</p><p>Nesse experimento clássico, adicionou-se a lectina concanavalina A à uma cultura de</p><p>amebas. Essa lectina reconhece especificamente a porção glicídica de glicoproteínas de</p><p>membrana, que atuam como receptores para concanavalina A. Esses receptores, que</p><p>normalmente se distribuem por toda a membrana, ao se ligarem à concanavalina, migraram</p><p>rapidamente para uma determinada região, na qual ficam concentrados formando um capuz</p><p>(cap formation).</p><p>Figura 4.6 Diferentes maneiras de proteínas se associarem a membranas celulares. A. Proteína</p><p>transmembranar de passagem única com a alfa-hélice embebida na bicamada lipídica. B. Proteína</p><p>transmembranar de múltipla passagem de alfa-hélices embebidas na membrana. C. Proteína</p><p>transmembranar formando barril b. D. Proteína inserida em uma das faces da bicamada lipídica. E.</p><p>Proteína ancorada à face interna da bicamada lipídica por meio do seu domínio lipídico. F. Proteína</p><p>ancorada à face externa da membrana plasmática por meio de um glicosilfosfatidilinositol (GPI),</p><p>ligado covalentemente à sua porção C-terminal (chamada “âncora de GPI”). G. Proteínas periféricas</p><p>da membrana, ligadas por interações não covalentes às proteínas integrais da face intracelular ou da</p><p>face extracelular da membrana plasmática.</p><p>Embora a composição lipídica influencie muito as propriedades biofísicas das membranas celulares, suas</p><p>funções específicas dependem do repertório das proteínas que as compõem. Essa importância é evidenciada pela</p><p>grande diversidade de proteínas de membrana, sendo estimado que 30% das proteínas codificadas pelo genoma</p><p>de células animais são de membrana. As proteínas de membrana podem ser receptores, enzimas, canais aquosos,</p><p>proteínas de reconhecimento célula–célula e adesão celular. Muitas proteínas de membrana formam também</p><p>grandes complexos multiproteicos que estão envolvidos em importantes processos, como a fotossíntese, a</p><p>formação do gradiente de prótons, o transporte de elétrons (formação de ATP) e os complexos transportadores</p><p>encontrados na membrana de peroxissomos e mitocôndrias (ver Capítulo 5).</p><p>As proteínas de membranas podem ser divididas em dois grandes grupos: as integrais ou intrínsecas e as</p><p>periféricas ou extrínsecas (ver Figura 4.2). Essa definição tem origem de observações empíricas de que algumas</p><p>proteínas são extraídas mais facilmente da membrana do que outras.</p><p>As proteínas integrais estão firmemente associadas aos lipídios da bicamada e só podem ser separadas da</p><p>fração lipídica por meio de agentes que rompam as interações hidrofóbicas e, consequentemente, a bicamada</p><p>lipídica, como detergentes ou solventes orgânicos. Cerca de 70% das proteínas de membrana são proteínas</p><p>integrais. Nessa categoria estão a maioria das enzimas da membrana, glicoproteínas responsáveis pelos grupos</p><p>sanguíneos, proteínas transportadoras, e receptores de hormônios e de outras moléculas.</p><p>As proteínas integrais de membrana, assim como os lipídios, apresentam regiões hidrofílicas e hidrofóbicas.</p><p>Essas proteínas inserem-se na bicamada lipídica por interação hidrofóbica entre suas regiões peptídicas</p><p>enriquecidas de aminoácidos hidrofóbicos, com as caudas dos lipídios. As regiões peptídicas onde predominam</p><p>aminoácidos hidrofílicos ficam expostas ao meio aquoso (Figuras 4.2 e 4.6).</p><p>Proteínas integrais de membrana podem interagir com a bicamada lipídica em uma das faces da membrana</p><p>(ver Figuras 4.2 e 4.6) ou atravessar inteiramente a bicamada lipídica, apresentando regiões expostas em ambas</p><p>as faces da membrana, sendo denominadas proteínas transmembranar (ver Figuras 4.2 e 4.6). As proteínas</p><p>transmembranar podem atravessar a membrana uma única vez, conhecidas também como proteínas</p><p>transmembranar de passagem única, ou podem ser mais longas e formar voltas, atravessando a membrana várias</p><p>vezes, sendo então denominadas “proteínas transmembranar de passagem múltipla” (ver Figura 4.6). A</p><p>conformação mais</p><p>comum pela qual as proteínas integrais interagem com a região hidrofóbica da bicamada</p><p>lipídica é a alfa-hélice. Nessa conformação as cadeias laterais hidrofóbicas dos aminoácidos interagem com as</p><p>caudas hidrofóbicas dos lipídios, e as regiões hidrofílicas direcionam-se para o interior da alfa-hélice formando</p><p>pontes de hidrogênio entre si. Essas proteínas podem também formar “caminhos” (canais iônicos e poros)</p><p>aquosos na membrana, em que aminoácidos, dispostos em alfa-hélice, expõem seus grupamentos hidrofílicos,</p><p>revestindo o interior desse canal (Figura 4.7). Essa conformação viabiliza a passagem seletiva de moléculas</p><p>solúveis em água, discutida em maiores detalhes mais adiante. Outra conformação possível para proteínas</p><p>transmembranar é a de folhas β. Essas podem se organizar em uma estrutura cilíndrica aberta, denominada</p><p>“barril β” (ver Figura 4.7). Essa estrutura também forma poros hidrofílicos na membrana, abundantes em</p><p>bactérias e na membrana externa de mitocôndrias e cloroplastos. Os poros formados por barril β são estruturas</p><p>grandes e rígidas, e os formados por alfa-hélice podem ter sua abertura e fechamento regulados, além de serem,</p><p>em geral, mais seletivos à passagem de solutos específicos.</p><p>Visualização das proteínas integrais de membrana</p><p>Pela técnica de criofratura, que consiste no congelamento rápido do tecido, seguido de sua</p><p>fratura, as superfícies de fratura são dissecadas e sombreadas com uma camada de metal</p><p>pesado depositada em ângulo agudo, seguida de uma camada de carbono que servirá de</p><p>suporte. Em seguida, os componentes celulares são dissolvidos, restando uma réplica da</p><p>superfície de fratura. Essa réplica é então analisada ao microscópio eletrônico. A membrana</p><p>celular sofre fratura na região entre as duas camadas lipídicas, porque os lipídios estão</p><p>presos por interações hidrofóbicas, um tipo de ligação fraca. Formam-se, assim,</p><p>artificialmente, duas lâminas que expõem as faces situadas no interior da membrana. A</p><p>lâmina interna, em contato com o citoplasma, expõe a denominada “face P”</p><p>(protoplasmática), e a externa expõe a chamada “face E” (externa). A face P está direcionada</p><p>para fora da célula e a face E para dentro dela. A técnica de criofratura mostra muito bem as</p><p>proteínas integrais da membrana, que aparecem como partículas presas principalmente à</p><p>face P, e a face E mostra as cavidades onde essas partículas estavam encaixadas (Figura 4.8).</p><p>As proteínas periféricas estão ligadas às proteínas integrais de membrana por ligações não covalentes, não</p><p>interagindo com a região hidrofóbica da bicamada lipídica (ver Figura 4.6). Por essa razão, essas proteínas</p><p>podem ser mais facilmente separadas da membrana por meio de tampões que conservam a integridade da</p><p>bicamada lipídica.</p><p>Figura 4.7 Padrões de enovelamento de proteínas transmembranar e formação de canais aquosos.</p><p>A. Proteínas transmembranar de passagem múltipla em α-hélice formam canais aquosos, em que o</p><p>interior é preenchido por regiões hidrofílicas das proteínas (em azul), permitindo passagem seletiva de</p><p>solutos. B. Proteínas transmembranar de passagem múltipla em folha b podem formar um poro</p><p>aquoso (barril b), preenchido por regiões hidrofílicas das proteínas que revestem seu interior.</p><p>Figura 4.8 Microscopia eletrônica de réplica da membrana plasmática criofraturada. A. A fratura</p><p>ocorre entre as lâminas interna e externa da bicamada lipídica da membrana citoplasmática. Esse</p><p>processo revela 4 superfícies: as faces interna e externa da lâmina externa e as faces interna e</p><p>externa da lâmina interna. A maioria das proteínas permanece aderida à face externa da lâmina</p><p>interna, direcionada para fora da célula (face P). Por isso, a face P das membranas plasmáticas</p><p>mostra numerosas partículas globulares. A face interna da lâmina externa, conhecida como face E,</p><p>apresenta poucas proteínas. B. Eletromicrografia da criofratura de uma membrana plasmática</p><p>(aumento de 150.000×). (B, cortesia de A. Martinez-Palomo.)</p><p>Outras proteínas se ligam à bicamada lipídica por uma cauda lipídica, ligada covalentemente a sua cadeia</p><p>peptídica. O ancoramento à região hidrofóbica da membrana ocorre por essa cauda lipídica, e a parte peptídica</p><p>fica totalmente externa à bicamada na região citoplasmática da membrana. Outras ficam voltadas para a região</p><p>não citoplasmática. Nesse caso, a ligação com a bicamada lipídica é feita por ancoramento de</p><p>glicosilfosfatidilinositol (GPI) (ver Figura 4.6).</p><p>Importância do revestimento de carboidratos na membrana</p><p>plasmática</p><p>A superfície extracelular da membrana plasmática contém lipídios e proteínas ligados covalentemente a</p><p>carboidratos, formando respectivamente glicolipídios e glicoproteínas (ver Figuras 4.2 e 4.9). Essa parte</p><p>glicídica pode ser muito complexa, contendo resíduos de D-glicose, D-galactose, N-acetil-D-galactosamina e de</p><p>ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico). Para a formação de glicoproteínas, os oligossacarídios são adicionados</p><p>às proteínas por ligações N-glicosídicas ou O-glicosídicas, no RE e no complexo de Golgi, respectivamente (ver</p><p>Capítulo 14). No primeiro caso, diz-se que o oligossacarídio está “N-ligado”, ou seja, está ligado a resíduos de</p><p>asparagina ou arginina. Os “O-ligados”, por sua vez, associam-se a resíduos de serina, treonina ou tirosina.</p><p>Algumas proteínas podem ainda se unir a várias longas cadeias de polissacarídios, formando macromoléculas</p><p>conhecidas como proteoglicanos.</p><p>Esses carboidratos conjugados a proteínas e lipídios de membrana formam um revestimento chamado</p><p>glicocálice, considerado uma extensão da própria membrana. Vale lembrar que a composição do glicocálice não</p><p>é sempre estática e pode variar conforme a região da membrana e a atividade funcional da célula em determinado</p><p>momento. Essa cobertura pode ser observada por técnicas de microscopia em que são utilizados corantes</p><p>específicos ou proteínas como a lectina, marcadas com imunofluorescência. Portanto, o glicocálice é constituído</p><p>por porções glicídicas de: (1) glicolipídios da membrana plasmática; (2) proteínas integrais da membrana; e (3)</p><p>glicoproteínas e proteoglicanos secretados pela célula e incorporados a esse revestimento (Figura 4.9). Devido à</p><p>íntima relação entre as moléculas intrínsecas da membrana plasmática e da matriz extracelular, o limite entre</p><p>essas duas porções não é bem definido.</p><p>O glicocálice tem a importante função de proteção da membrana celular contra danos químicos e mecânicos,</p><p>atuando como uma barreira. Por exemplo, o glicocálice de células do revestimento gastrintestinal as protege do</p><p>contato direto com alimentos ingeridos e enzimas digestivas. Importante lembrar que essa cobertura é encontrada</p><p>somente na porção direcionada para o meio externo (não citoplasmática) da membrana plasmática.</p><p>Glicoproteínas e glicolipídios são também encontrados na superfície não citoplasmática (voltadas para o lúmen)</p><p>de algumas organelas envoltas por membrana, como no caso do RE e do complexo de Golgi (onde são</p><p>produzidos para serem posteriormente entregues à membrana plasmática), e dos lisossomos (ver Capítulos 14 e</p><p>15). No caso de lisossomos, essa cobertura fornece proteção contra enzimas hidrolíticas presentes na organela.</p><p>Outra importante função do glicocálice é conferir a identidade celular. A grande variedade de combinações</p><p>possíveis na formação das cadeias de oligossacarídios produz assinaturas únicas na superfície celular. Apesar de</p><p>serem formadas por cerca de 15 tipos diferentes de açúcares como glicose, manose, frutose e galactose, existe</p><p>uma grande diversidade de ligações químicas possíveis entre eles, portanto a mesma composição pode formar</p><p>cadeias de diferentes estruturas ou cadeias ramificadas que aumentam muito as possíveis combinações (Figura</p><p>4.10). Desse modo, centenas de combinações diferentes podem ser constituídas com apenas três tipos de</p><p>açúcares. Superfícies de diferentes tipos celulares apresentam uma combinação única de cadeias ramificadas de</p><p>carboidratos, específica para os indivíduos de uma mesma espécie. Essas assinaturas de carboidratos estão</p><p>envolvidas no reconhecimento intercelular</p><p>e nos processos transitórios de adesão como, por exemplo, na</p><p>coagulação sanguínea, em respostas inflamatórias e imunes, interações espermatozoide–óvulo e patógeno–célula</p><p>hospedeira.</p><p>Figura 4.9 Componentes da membrana plasmática que compõem o glicocálice: em verde, estão as</p><p>glicoproteínas (integrais ou associadas); em roxo, os proteoglicanos associados; em vermelho,</p><p>resíduos de carboidratos.</p><p>Figura 4.10 Diversidade de cadeias de carboidratos de glicoproteínas. Nesse exemplo, é mostrado</p><p>como é possível produzir várias combinações de oligossacarídios em proteínas de membrana (em</p><p>verde, abaixo) com apenas seis carboidratos diferentes (mostrados em diferentes cores e formatos).</p><p>Devido a essa grande diversidade combinatorial para formação de oligossacarídios, formam-se</p><p>superfícies celulares distintas.</p><p>Sistemas de grupo sanguíneo ABO</p><p>Um bom exemplo de marcadores da superfície celular são as glicoproteínas e os glicolipídios</p><p>que definem os grupos sanguíneos ABO (Figura 4.11). Esses grupos dependem de pequenas</p><p>variações na estrutura dos carboidratos que compõem glicolipídios e glicoproteínas da</p><p>membrana das hemácias. Os indivíduos com sangue do tipo A apresentam o açúcar N-</p><p>acetilgalactosamina em determinada posição da cadeia de carboidratos exposta no</p><p>glicocálice. Os indivíduos com o sangue do tipo B têm, na mesma posição, a galactose. Já os</p><p>indivíduos tipo AB têm ambos: galactose e N-acetilgalactosamina. No sangue de indivíduos</p><p>do tipo O, a mesma posição está desocupada.</p><p>Figura 4.11 Oligossacarídios da membrana de hemácias responsáveis pelos grupos sanguíneos</p><p>ABO.</p><p>Complexo MHC</p><p>Como acontece com as macromoléculas em geral, as proteínas da membrana são</p><p>imunogênicas, isto é, promovem uma resposta imune quando penetram em um organismo</p><p>estranho. Por exemplo, o transplante de tecidos de um animal para outro estimula o animal</p><p>receptor a produzir células e anticorpos que atacam as proteínas da membrana plasmática</p><p>das células transplantadas. Em humanos e em outros mamíferos, o mecanismo para</p><p>distinguir o que é próprio do organismo (self) daquilo que é estranho (non-self) depende de</p><p>um grupo de moléculas glicoproteicas da membrana plasmática, denominadas “complexo</p><p>principal de histocompatibilidade”, ou MHC (do inglês major histocompatibility complex).</p><p>Há duas classes de MHC: MHC I e MHC II. Todas as células do organismo apresentam MHC</p><p>I e algumas células específicas do sistema imune apresentam o MHC II. Os dois MHCs são</p><p>glicoproteínas cujas sequências peptídicas têm uma região constante e uma variável. A</p><p>sequência de aminoácidos da região variável difere muito a cada pessoa, de tal maneira que</p><p>não existe a possibilidade de serem produzidos conjuntos de proteínas de MHC idênticos</p><p>entre diferentes indivíduos. A única exceção são os gêmeos univitelinos (ou idênticos), por</p><p>serem geneticamente iguais. Nesses gêmeos, as proteínas celulares – inclusive as do MHC –</p><p>são idênticas. Para minimizar a resposta imune e a consequente rejeição de transplantes,</p><p>procuram-se doadores cujos complexos MHC sejam o mais semelhante possível aos do</p><p>receptor.</p><p>Membranas celulares são assimétricas e apresentam domínios</p><p>específicos</p><p>Organelas distintas diferem quanto à composição e à função das membranas que as delimitam. Como discutido</p><p>anteriormente, as membranas de organelas têm propriedades enzimáticas muito diferentes, refletida</p><p>estruturalmente na diversidade de sua constituição lipídica e proteica, portanto, embora a organização molecular</p><p>básica das membranas seja a mesma (mosaico fluido da bicamada lipídica e presença de proteínas), elas variam</p><p>quanto à sua composição química e propriedades biológicas. Além disso, com o aperfeiçoamento das técnicas de</p><p>preparação dos tecidos para estudo ao microscópio eletrônico, observou-se que em uma mesma membrana há</p><p>diferenças na espessura de suas lâminas. Esse foi o primeiro indicativo, mais tarde confirmado, que alguns</p><p>componentes das membranas podem não estar homogeneamente distribuídos em sua extensão e nas diferentes</p><p>faces da bicamada lipídica.</p><p>Assimetria das membranas celulares</p><p>As duas faces da membrana plasmática são assimétricas, assim como a sua composição lipídica e proteica (ver</p><p>Figuras 4.2 e 4.9). Essa assimetria está relacionada com funções específicas de diferentes tipos celulares e de</p><p>organelas presentes em células eucarióticas. A presença de glicoproteínas e glicolipídios somente na face</p><p>extracelular da membrana plasmática é um exemplo clássico dessa assimetria e da sua importância funcional.</p><p>A composição lipídica de cada face da bicamada lipídica de membranas celulares pode diferir muito. Por</p><p>exemplo, na membrana das hemácias humanas, a camada lipídica externa é mais rica em fosfatidilcolina e</p><p>esfingomielina, e na camada lipídica em contato com o citoplasma predominam fosfatidiletanolamina e</p><p>fosfatidilserina. Note que, como a fosfatidilserina tem carga negativa, essa assimetria ocasiona também uma</p><p>diferença de carga elétrica (ver Figura 4.9). A assimetria na composição lipídica também é importante na</p><p>sinalização celular. O fosfatidilinositol, por exemplo, é um fosfolipídio encontrado preferencialmente na camada</p><p>interna da membrana plasmática. Esse fosfolipídio pode ser modificado por fosforilações (ver Capítulo 15),</p><p>criando sítios específicos de recrutamento de proteínas sinalizadoras. Uma de suas formas fosforiladas (PI 4,5-</p><p>bifosfato) é reconhecida pela fosfolipase C ativada, o que, entre outros efeitos, ativa a proteinoquinase C (PKC)</p><p>e, consequentemente, inicia várias vias de sinalização celular (ver Capítulo 6).</p><p>A assimetria na composição lipídica nas duas camadas é mantida e regulada por uma série de enzimas</p><p>translocadoras de lipídios, durante a produção de novas porções da membrana. Em células eucarióticas, a</p><p>produção de novas moléculas de fosfolipídios ocorre na face citoplasmática da membrana do RE liso. Alguns</p><p>desses novos fosfolipídios devem ser transferidos para a monocamada oposta, para que a bicamada cresça</p><p>proporcionalmente (ver Capítulo 14). Como o movimento de flip-flop é raro (ver Figura 4.3), essa transferência é</p><p>catalisada e regulada por enzimas denominadas flipases (translocases). Algumas dessas enzimas catalisam a</p><p>transferência de fosfolipídios específicos para um dos lados da membrana, produzindo a assimetria na</p><p>membrana.</p><p>Fosfatidilserina e a apoptose</p><p>Em células animais, a assimetria dos fosfolipídios de membrana distingue células vivas das</p><p>que estão em processo de apoptose. A fosfatidilserina é um fosfolipídio de membrana que é</p><p>normalmente encontrado na face citoplasmática da membrana plasmática. Quando uma</p><p>célula sofre apoptose (um tipo de morte celular regulada – ver Capítulo 16), a fosfatidilserina</p><p>é rapidamente translocada para a face externa da membrana plasmática. Acredita-se que isso</p><p>ocorra por ativação de translocases que transferem fosfolipídios de uma face a outra da</p><p>bicamada lipídica de modo inespecífico (conhecidas como “escrambases”) e inativação do</p><p>translocador de fosfatidilserina. A exposição de fosfatidilserina é um sinal reconhecido por</p><p>macrófagos, que fagocitam as células em apoptose. Graças a essa fagocitose seletiva de</p><p>células mortas, não há extravasamento do conteúdo citoplasmático, evitando a inflamação.</p><p>Assim, a morte celular não interfere na função das células vizinhas, chamada por isso “morte</p><p>limpa”.</p><p>Durante a produção de novas porções de membrana, a assimetria proteica é obtida pela inserção de proteínas</p><p>recém-sintetizadas na membrana do RE, em orientações específicas. Essas orientações posicionam a região N-</p><p>terminal ou C-terminal em relação à face da membrana. A orientação da inserção da proteína na membrana é</p><p>dada pela própria sequência peptídica, como será discutido em mais detalhes no Capítulos 13 e 14. Outras</p><p>proteínas podem ser ancoradas a uma ou outra face da membrana de forma específica após sua síntese. Por</p><p>exemplo, as proteínas ancoradas por GPI ou cauda lipídica (ver Figura 4.6) têm essas âncoras adicionadas após a</p><p>tradução. A distribuição de proteínas periféricas também contribui para a assimetria</p><p>proteica nas membranas.</p><p>Como ilustrado nas Figuras 4.2 e 4.6, as proteínas periféricas estão concentradas na face citoplasmática da</p><p>membrana plasmática, onde podem ligar-se a filamentos do citoesqueleto. O domínio extracelular das proteínas</p><p>integrais, com seus resíduos glicídicos, fica exposto na face externa da membrana com as glicoproteínas, os</p><p>glicolipídios e os proteoglicanos adsorvidos à membrana, formando o glicocálice.</p><p>As novas porções de membrana são entregues a diferentes organelas pelas vesículas de transporte (ver</p><p>Capítulos 14 e 15), as quais mantêm a assimetria e a orientação da membrana, onde se pode distinguir uma face</p><p>citoplasmática, em contato com o citoplasma, e outra não citoplasmática. A face não citoplasmática corresponde</p><p>topologicamente àquela direcionada para o lúmen das organelas e para o meio extracelular (na membrana</p><p>plasmática; Figura 4.12). Os glicolipídios e as glicoproteínas estão, portanto, sempre voltados para o lúmen das</p><p>vesículas e das organelas, nunca expostos ao citoplasma.</p><p>Membranas apresentam domínios com funções específicas</p><p>Além da assimetria entre as duas faces das membranas, observa-se também a formação de regiões enriquecidas</p><p>por tipos específicos de moléculas (tanto lipídicas quanto proteicas), relacionados com funções daquela região da</p><p>membrana, denominadas “domínios de membrana”. Esses domínios podem ser divididos em dois tipos: (1)</p><p>microdomínios transientes e dinâmicos, e, em geral, modulados em resposta a sinais intra e extracelulares; ou (2)</p><p>domínios de membrana, observados em grandes áreas da membrana. Em geral os domínios de membrana são</p><p>mais estáveis.</p><p>A formação dos microdomínios transientes foi observada em experimentos em laboratório, utilizando-se</p><p>diferentes misturas de lipídios para formação de bicamadas lipídicas artificiais. Esses ensaios mostraram que,</p><p>dependendo das concentrações utilizadas, alguns lipídios têm maior afinidade entre si, e formam microdomínios</p><p>transientes com composição lipídica específica, conhecidas como balsas lipídicas (Figura 4.13). Essas balsas</p><p>lipídicas são enriquecidas em esfingolipídios e colesterol. Em membranas de células animais, sua organização e</p><p>manutenção requer também a participação de proteínas específicas de membrana, como as ancoradas por GPI</p><p>(ver Figura 4.13). Os esfingolipídios têm cadeias de hidrocarbonetos mais longas, aumentando a espessura das</p><p>regiões de membrana na qual se concentram. Isso pode acomodar mais facilmente certas proteínas de membrana</p><p>(ver Figura 4.13), funcionando como uma plataforma. A formação desse domínio é um processo coordenado e</p><p>transitório, que envolve recrutamento de lipídios e proteínas específicos para a realização de determinada função.</p><p>Por exemplo, regiões da membrana plasmática envolvidas em endocitose (ver Capítulo 15) podem recrutar a</p><p>proteína caveolina (ver Figura 4.15), formando um domínio de membranas conhecido como cavéola, importante</p><p>para algumas vias endocíticas (ver Capítulo 15). O estabelecimento desses domínios também é importante para</p><p>aproximar proteínas cujas funções conjuntas são necessárias para reações bioquímicas específicas, como a</p><p>transmissão bioquímica de sinais extracelulares que depende da fosforilação sequencial de proteínas de</p><p>membrana; ou seja, sinais extracelulares interagem e ativam receptores de membrana que, por sua vez, ativam</p><p>uma sequência de reações de fosforilação de proteínas associadas à membrana (ver Capítulo 6). A proximidade</p><p>dessas enzimas com os seus substratos nas plataformas de membrana aumenta a velocidade das reações e,</p><p>consequentemente, a velocidade de sinalização.</p><p>Figura 4.12 Entrega de novas porções de membrana, produzidas no retículo endoplasmático, para a</p><p>membrana plasmática. Note a topologia da membrana quando a vesícula se insere na membrana</p><p>plasmática. A superfície que está direcionada para o lúmen da vesícula (em azul-claro) passa a ficar</p><p>exposta ao meio extracelular quando se funde à membrana plasmática. A superfície da membrana da</p><p>vesícula que está voltada para o citoplasma (em azul-escuro) continua exposta ao citoplasma. Essa</p><p>topologia é originada já na produção de novas porções de membrana, no retículo endoplasmático, e</p><p>mantida durante todo o processo de maturação (passando pelo complexo de Golgi), transporte e</p><p>entrega para a membrana plasmática.</p><p>Figura 4.13 Região de balsa lipídica na membrana plasmática. Essa região é rica em esfingomielina e</p><p>colesterol. A composição lipídica nessa região é mais espessa, facilitando a concentração de</p><p>proteínas específicas.</p><p>Os domínios de membrana são mais estáveis e abrangem regiões maiores. Esses domínios são detectáveis em</p><p>tipos celulares que apresentam polaridade celular, como células epiteliais e neurônios. A polaridade celular é</p><p>definida pela distribuição assimétrica de organelas e componentes de membrana de uma mesma célula. Por</p><p>exemplo, as células epiteliais de revestimento do intestino apresentam uma região da membrana que está em</p><p>contato com o meio externo (lúmen do intestino) e uma modificação nessa região de sua membrana denominada</p><p>“microvilos” (Figura 4.14). Esses microvilos aumentam a superfície de contato dessa região de membrana com o</p><p>meio externo (importante para sua função absortiva); além disso, contêm enzimas responsáveis pelas fases finais</p><p>da digestão de proteínas e carboidratos (dipeptidases e dissacaridases, respectivamente). Devido a essas</p><p>características, a membrana dessas células é dividida em domínio apical, região direcionada para o lúmen, e</p><p>domínio basolateral. O domínio apical inclui os microvilos, e o domínio basolateral é a região da membrana que</p><p>não tem contato com o lúmen, apresentando outra composição de proteínas (ver Figura 4.14).</p><p>Os conceitos de domínios de membrana e mosaico fluido parecem conflitantes, pois, de acordo com esse</p><p>último, as proteínas e os lipídios movem-se livremente no plano da bicamada lipídica. Dessa maneira, espera-se</p><p>que essas moléculas sejam distribuídas homogeneamente, porém, como abordado anteriormente, essa</p><p>distribuição casual não se aplica em todos os casos.</p><p>Além das interações que ocorrem nos microdomínios transientes, as células têm outros mecanismos para</p><p>restringir o movimento de proteínas e lipídios. Essa restrição resulta na criação e na manutenção dos domínios de</p><p>membrana. Um deles envolve a formação de grandes complexos proteicos que apresentam limitações de</p><p>movimentação pela membrana (Figura 4.15). A ligação de proteínas da membrana de uma célula com as de uma</p><p>célula adjacente também restringe a movimentação dessas proteínas (ver Figura 4.15). Esse tipo de estrutura</p><p>pode ainda formar uma barreira que impede a passagem de outras proteínas por aquela região, mantendo</p><p>domínios como os vistos em células epiteliais do intestino (ver Figura 4.14). Outra maneira de restringir a</p><p>movimentação das proteínas de membrana é prendendo-as a complexos proteicos extracelulares, proteínas da</p><p>matriz extracelular ou intracelulares, como as proteínas do citoesqueleto (ver Figura 4.15).</p><p>Figura 4.14 Polaridade de células epiteliais de revestimento do intestino delgado. O domínio apical</p><p>(orientado para o meio externo, ou seja, o lúmen intestinal) apresenta microvilos e proteínas próprias</p><p>dessa região (em azul). O domínio basolateral (região da membrana que está em contato com o meio</p><p>interno) também contém suas proteínas específicas (círculos vermelhos). Note que há uma estrutura</p><p>proteica (em verde) que conecta as membranas de células epiteliais adjacentes próximo ao domínio</p><p>apical, separando o meio externo do interno. Essa estrutura é conhecida como junções oclusivas (ver</p><p>Capítulo 8).</p><p>O córtex celular é a principal estrutura que fornece ancoramento às proteínas da face interna da membrana</p><p>plasmática (ver Capítulo 7). O córtex celular é uma rede de citoesqueleto rica em filamentos de actina subjacente</p><p>à membrana plasmática. A interação do córtex celular com proteínas da membrana plasmática ocorre em muitos</p><p>pontos e restringe a movimentação das proteínas que fazem parte dessa estrutura. Também cria barreiras</p><p>mecânicas</p><p>(como currais) na parte citoplasmática da membrana, confinando as proteínas ali presentes (Figura</p><p>4.16).</p><p>Figura 4.15 Mecanismos de restrição de mobilidade de proteínas de membrana (em verde). A. A</p><p>ligação entre proteínas da mesma célula formam estruturas grandes que apresentam limitações de</p><p>movimentação. B. Ligação entre proteínas da membrana de células adjacentes fixa essas proteínas e</p><p>cria uma barreira para passagem de outras moléculas por aquela região. C. Ligação com proteínas</p><p>presentes do lado externo da membrana como, por exemplo, proteínas do glicocálice (em laranja). D.</p><p>Ligação com proteínas do citoesqueleto (em amarelo) pelo lado citoplasmático.</p><p>Figura 4.16 Interação do citoesqueleto subjacente (em vermelho) com proteínas de membrana (em</p><p>verde) auxilia na formação de domínios de membrana. Essa interação forma barreiras mecânicas</p><p>(“currais”) que cercam algumas proteínas (em roxo), restringindo sua movimentação. Note que as</p><p>proteínas transmembranar são impedidas de entrar no domínio delimitado pelo citoesqueleto.</p><p>Córtex celular da membrana de uma hemácia humana</p><p>A membrana dos eritrócitos de mamíferos é um bom modelo experimental para o estudo de</p><p>proteínas de membrana. Nessas células, a única membrana existente é a membrana</p><p>plasmática, que pode ser isolada com o citoesqueleto subjacente (córtex celular; Figura 4.17).</p><p>A forma bicôncava, que é característica dessas células, deve-se à existência e à interação de</p><p>proteínas de membrana e de citoesqueleto adjacente, composto principalmente da proteína</p><p>filamentosa espectrina. Essa proteína é específica do eritrócito e organiza-se em uma rede</p><p>que se liga a proteínas de membrana em vários pontos, formando uma malha flexível. Essa</p><p>flexibilidade possibilita que os eritrócitos mudem de forma quando passam por capilares</p><p>muito estreitos e depois retornem a sua configuração bicôncava sem ficarem deformadas.</p><p>Problemas que afetem essa estrutura, como mutações no gene da espectrina, causam</p><p>anemia. Nessa patologia, os eritrócitos deformam-se irreversivelmente e são destruídos após</p><p>passarem pelos capilares.</p><p>Permeabilidade seletiva das membranas celulares</p><p>Os compartimentos envoltos por membrana apresentam meios muito distintos entre si, tanto pela composição de</p><p>solutos quanto pelas concentrações destes (Figura 4.18). Pode-se exemplificar o fato pela concentração dos íons</p><p>Na+ e K+ em células animais, comparando-se os meios interno (citoplasma) e externo. O primeiro tem uma</p><p>concentração extracelular muito maior que a intracelular (mais de 10 vezes), o oposto acontece com a</p><p>concentração de K+. O Ca2+, outro íon importante em várias funções celulares, incluindo a de sinalização (ver</p><p>Capítulos 6, 14 e 15), tem uma concentração extremamente baixa no citoplasma, comparada à sua concentração</p><p>no meio extracelular e no RE. Além da diferença de concentração de solutos entre os diferentes compartimentos,</p><p>existe também uma influência das cargas desses íons, em que pequenos excessos de íons de carga positiva ou</p><p>negativa, próximos à membrana plasmática, provocam uma diferença elétrica entre as duas faces da membrana.</p><p>Essas diferenças produzem compartimentos mais especializados e gradientes eletroquímicos (discutido a seguir),</p><p>importantes para a eficiência das reações bioquímicas na célula. Desse modo, a distribuição e a passagem de</p><p>solutos através dessas membranas celulares são altamente controladas. As características da bicamada lipídica e</p><p>as proteínas que regulam o transporte de moléculas definem a permeabilidade seletiva de uma membrana.</p><p>Permeabilidade seletiva da bicamada lipídica</p><p>As bicamadas lipídicas são uma barreira para a passagem de substâncias polares e hidrossolúveis, incluindo íons,</p><p>mas permitem mais facilmente a passagem de substâncias pequenas, lipossolúveis ou apolares. A velocidade da</p><p>travessia dessas substâncias varia de acordo com as características químicas de cada molécula. Moléculas</p><p>apolares e pequenas, como O2 e CO2, assim como moléculas hidrofóbicas, como hormônios esteroides, cruzam a</p><p>membrana facilmente. Pequenas moléculas polares não carregadas, como H2O e etanol, podem se difundir pela</p><p>membrana, mas com velocidade menor. Grandes moléculas polares não carregadas, como a glicose ou sacarose,</p><p>apresentam muita dificuldade para atravessar essa barreira.</p><p>Figura 4.17 Hemácia humana. A. A hemácia apresenta um formato de disco bicôncavo. B. Cortéx</p><p>celular e sua interação com proteínas da membrana responsáveis pela manutenção desse formato.</p><p>Figura 4.18 As características semipermeáveis das membranas celulares possibilitam a formação e a</p><p>manutenção de diferentes concentrações de solutos em compartimentos subcelulares. No exemplo,</p><p>são mostradas diferenças de concentração de íons no meio extracelular, no citoplasma (meio</p><p>intracelular) e no retículo endoplasmático (RE). Os íons cálcio, por exemplo, estão mais concentrados</p><p>no meio extracelular e no RE; sua concentração no citoplasma é muito baixa.</p><p>Essas moléculas grandes, polares e hidrossolúveis cruzam a bicamada lipídica por meio de proteínas de</p><p>transporte. Estas proteínas são específicas para diferentes solutos, portanto diferentes membranas apresentam</p><p>conjuntos específicos de proteínas de transporte.</p><p>Proteínas de transporte dividem-se em transportadoras, canais iônicos e poros</p><p>Existe uma grande variedade de proteínas de transporte em membranas, que, de modo geral, forma “caminhos”</p><p>hidrofílicos que permitem a passagem seletiva de pequenas moléculas pela bicamada lipídica. De acordo com seu</p><p>modo de ação e seleção dos solutos que transportam, esses caminhos podem ser classificados em: canais iônicos,</p><p>poros e transportadores (também conhecidos como “permeases” ou “proteínas carreadoras”).</p><p>Os canais iônicos funcionam como um pequeno túnel por onde passam íons de tamanho e carga elétrica</p><p>específicos, geralmente exclusivos para um único tipo de íon. Esses canais assumem diferentes conformações</p><p>que podem impedir (fechado) ou permitir (aberto) a passagem dos íons. Os canais que dependem de estímulo</p><p>para que essa mudança ocorra denominam-se canais com comporta (Figura 4.19). Existem, assim, canais</p><p>dependentes de ligante (respondem a ligantes específicos), dependentes de voltagem (respondem a mudanças na</p><p>voltagem da membrana) e mecano dependentes (respondem à pressão mecânica). Os canais que não dependem</p><p>de estímulo para alternar os estados aberto e fechado são nomeados canais de vazamento ou sem comporta.</p><p>Os poros são canais hidrofílicos formados através da membrana, que, diferentemente dos iônicos, estão</p><p>sempre abertos, como as aquaporinas.</p><p>Figura 4.19 Proteínas de transporte através da membrana. A. Canal iônico: uma proteína</p><p>transmembranar que forma um “caminho” hidrofílico, podendo estar no estado aberto ou fechado. B.</p><p>Canal iônico dependente de ligante: nesse exemplo, a abertura do canal é regulada por ligante</p><p>específico. C. Transportador: também forma um “caminho” pela membrana, porém, nesse caso, há</p><p>uma interação forte com o soluto a ser transportado, que leva a mudanças conformacionais em sua</p><p>estrutura, possibilitando a abertura desse caminho.</p><p>Os transportadores (ou permeases) têm como característica a ligação de alta afinidade com o soluto que será</p><p>transportado, similar à ligação de uma enzima com seu substrato. Essa ligação modifica a conformação do</p><p>transportador, possibilitando a transferência do soluto para o outro lado da membrana. Essa interação garante a</p><p>especificidade desse transporte (ver Figura 4.19). Esses transportadores podem ser classificados como uniporte</p><p>(monoporte) – transporta somente um soluto específico; simporte (cotransporte) – transporta dois tipos de soluto</p><p>no mesmo sentido ou antiporte (contratransporte) – transporta dois tipos de soluto em sentidos opostos (Figura</p><p>4.20). É importante salientar que tanto no caso do simporte como do antiporte, o transporte dos dois solutos é</p><p>acoplado, um não ocorre sem o outro.</p><p>Ionóforos aumentam a permeabilidade da membrana celular</p><p>Existem moléculas relativamente pequenas – ionóforos – que, por apresentarem regiões</p><p>hidrofóbicas,</p><p>podem ser incorporadas às membranas biológicas. Essa incorporação provoca o</p><p>aumento da permeabilidade das membranas a vários tipos de íons. Esses ionóforos são</p><p>considerados proteínas de transporte móveis que funcionam como canais ou como</p><p>transportadores.</p><p>Transporte de pequenas moléculas através da membrana celular</p><p>Pequenas moléculas atravessam a membrana plasmática por transporte passivo (sem gasto de energia) ou</p><p>transporte ativo (com gasto de energia) (Figura 4.21). O transporte passivo pode ocorrer por canais iônicos,</p><p>poros e transportadores. O transporte ativo ocorre somente por meio de transportadores.</p><p>O transporte passivo ocorre pela difusão de solutos</p><p>O sentido e a força (velocidade) do transporte passivo dependem da diferença de concentração dos solutos nos</p><p>dois lados da membrana, seguindo o princípio da difusão de solutos. Desse modo, as moléculas migram da região</p><p>de maior concentração para a de menor concentração espontaneamente (ver Figura 4.21). Além da diferença de</p><p>concentração, deve-se considerar também a diferença das cargas elétricas entre dois compartimentos e a carga</p><p>elétrica do soluto a ser transportado. A diferença de concentração entre dois compartimentos é denominada</p><p>“gradiente de concentração” e a diferença de carga elétrica é conhecida como gradiente de voltagem (ou</p><p>diferença de potencial elétrico). O somatório dessas duas “forças” é intitulado gradiente eletroquímico (ver</p><p>Figura 4.21).</p><p>Figura 4.20 Tipos de transporte mediados por transportador. Os transportadores podem transportar</p><p>um único soluto (uniporte) ou dois solutos – no mesmo sentido (simporte) ou em sentidos opostos</p><p>(antiporte). Independentemente do sentido, esses transportes serão sempre acoplados (cotransporte).</p><p>O transporte a favor desse gradiente depende somente da existência de “caminhos” através da membrana.</p><p>Assim, substâncias que podem se difundir através da bicamada lipídica (como discutido anteriormente) realizam</p><p>a travessia por difusão simples (Figura 4.22). Já para as moléculas que são barradas pela bicamada lipídica (p.</p><p>ex., moléculas com carga ou polares sem carga), essa passagem é realizada através de canais ou transportadores,</p><p>sendo conhecida como difusão facilitada ou transporte passivo (ver Figura 4.21).</p><p>Velocidade da difusão simples é diferente da difusão facilitada</p><p>Como a difusão facilitada (transporte passivo) depende de proteínas de transporte, a</p><p>velocidade desse transporte é limitada pelo número dessas proteínas na membrana. A</p><p>velocidade máxima, que só é atingida em condições experimentais, ocorre quando todas as</p><p>proteínas de transporte estiverem ocupadas (saturação das proteínas transportadoras).</p><p>Nessas condições, o soluto que atravessa a membrana livremente por difusão simples, não</p><p>tem um limite de transporte, porque sua passagem independe de um mediador. Por outro</p><p>lado, no soluto cuja passagem ocorre por difusão facilitada, o aumento de sua concentração</p><p>não altera a velocidade do transporte porque as proteínas de transporte já estão atuando na</p><p>sua capacidade máxima (ver Figura 4.22). Esse tipo de experimento ilustra claramente a</p><p>diferença entre difusão simples e facilitada.</p><p>A velocidade de transporte entre canais e transportadores também difere. Os canais, uma</p><p>vez abertos, tornam possível a livre passagem da molécula a ser transportada. Os</p><p>transportadores, por sua vez, apresentam um sítio onde a molécula a ser transportada se</p><p>liga. Essa interação induz a mudança conformacional no transportador necessária para que a</p><p>molécula atravesse a membrana (ver Figura 4.19).</p><p>As membranas celulares são relativamente permeáveis à água e, nesse caso, o sentido do movimento das</p><p>moléculas de água depende do gradiente osmótico, ou seja, de um compartimento com menor concentração de</p><p>solutos (alta concentração de água) para aquele de maior concentração (baixa concentração de água). As</p><p>membranas plasmáticas também apresentam canais especializados para passagem de água, denominados</p><p>“aquaporinas”.</p><p>Figura 4.21 Influência do gradiente eletroquímico nos transportes ativo e passivo. Os solutos estão</p><p>mais concentrados no meio externo da bicamada lipídica e formam um gradiente químico. Dessa</p><p>maneira, tenderão a entrar na célula caso haja um “caminho”. A. Ocorre difusão sem gasto energético</p><p>pela bicamada lipídica (passiva) de uma molécula lipossolúvel (triângulo amarelo), B e C. As</p><p>moléculas com carga (círculo verde) ou polar sem carga (quadrado roxo) atravessam a membrana a</p><p>favor de seu gradiente químico (passivo), mas precisam do seu respectivo canal ou transportador. D e</p><p>E. O transporte do soluto contra seu gradiente químico depende de gasto de energia (transporte</p><p>ativo). A membrana celular apresenta no meio interno uma carga líquida negativa em relação ao meio</p><p>extracelular; forma-se, então, um gradiente elétrico que também influencia a passagem das</p><p>moléculas. Em B, porque a carga da molécula (círculo verde) é positiva, o sentido do seu transporte</p><p>está a favor de seu gradiente químico e elétrico. Em D, o transporte do íon (círculo vermelho) é a</p><p>favor de seu gradiente elétrico, mas contra seu gradiente químico e por isso precisa de gasto</p><p>energético. Em E, o íon (hexágono azul) precisa ser transportado contra seu gradiente químico e</p><p>elétrico, portanto, precisa de gasto energético também.</p><p>Figura 4.22 Comparação da velocidade de difusão por uma membrana em função da concentração</p><p>do soluto. O aumento da concentração de solutos que passam livremente pela membrana (difusão</p><p>simples) é proporcional ao aumento da velocidade de sua difusão. Solutos que precisam de uma</p><p>proteína para atravessar a membrana (difusão facilitada) apresentam uma velocidade máxima de</p><p>difusão; nessas condições, a velocidade de transporte não aumenta, mesmo com o aumento da</p><p>concentração de soluto.</p><p>Alteração do volume celular devido à pressão osmótica</p><p>Células animais em solução hipotônica sofrem intumescimento, devido à pressão osmótica.</p><p>Se essa pressão for muito grande, o acentuado aumento do volume celular leva ao</p><p>rompimento da membrana plasmática e ao extravasamento do conteúdo celular (lise celular).</p><p>Quando colocadas em solução hipertônica, as células perdem água, diminuindo seu volume.</p><p>Em soluções isotônicas, o volume e a forma da célula não se alteram (ver Figura 4.1). Nas</p><p>células das plantas, ocorre fenômeno semelhante, porém, devido à presença da parede de</p><p>celulose, as consequências são diferentes. Em solução hipertônica, as células das plantas</p><p>perdem água e diminuem de volume, separando-se o citoplasma da parede celular, a qual é</p><p>rígida. Esse fenômeno é chamado “plasmólise”. Quando colocada em meio hipotônico, a</p><p>célula vegetal tem seu volume aumentado, mas não se rompe. A presença da parece celular</p><p>limita o aumento de volume da célula e a mantém dentro de uma faixa que não excede a</p><p>resistência da membrana plasmática. O aumento de volume sofrido por uma célula vegetal,</p><p>ao passar de uma solução hipertônica para uma solução hipotônica, chama-se</p><p>“desplasmólise” (ver Figura 4.1).</p><p>O transporte ativo ocorre contra o gradiente de concentração ou elétrico</p><p>O transporte ativo, que ocorre com gasto de energia, é outro processo pelo qual moléculas atravessam as</p><p>membranas. Nesse caso, a substância é transportada do lado da membrana onde sua concentração é baixa para o</p><p>lado onde sua concentração é alta. Esse transporte, portanto, ocorre contra um gradiente de concentração (no caso</p><p>de solutos não carregados eletricamente) ou um gradiente eletroquímico (quando o soluto é ionizado) (ver Figura</p><p>4.21). Por exemplo, a concentração de íons sódio (Na+) é mais alta no meio extracelular do que no citoplasma.</p><p>Quando a célula transporta esses íons do citoplasma para o meio extracelular, dois obstáculos devem ser</p><p>vencidos: a maior concentração de Na+ e a carga mais positiva do meio extracelular, próximo à face externa da</p><p>membrana plasmática (ver Figura 4.21).</p><p>O transporte ativo é realizado por transportadores do tipo uniporte, simporte ou antiporte (ver Figura 4.20),</p><p>podendo ser classificado em transporte ativo primário (dependente de bombas de ATP)</p><p>ou transporte ativo</p><p>secundário (dependente de gradiente iônico).</p><p>No transporte ativo primário, o transportador é também conhecido como “bomba”. A bomba utiliza</p><p>diretamente um gasto energético (como a quebra de uma molécula de ATP) para transportar um soluto (ou dois,</p><p>no caso de cotransporte) contra um gradiente eletroquímico. A bomba de Na+/K+ (ATPase Na+/K+) é um dos</p><p>exemplos mais bem estudados desse tipo de transporte. Essa bomba é um transportador antiporte que transporta</p><p>Na+ para o meio extracelular e K+ para o meio intracelular (Figura 4.23). Existem várias outras bombas</p><p>importantes para a manutenção de diferenças de concentração entre compartimentos celulares que funcionam de</p><p>modo similar. São exemplos: a bomba K+/H+, encontrada na membrana plasmática de células epiteliais do</p><p>revestimento do estômago, importante para formação do suco gástrico; bombas de H+ na membrana de</p><p>endossomos e lisossomos, responsáveis pela manutenção de um pH mais baixo nessas organelas; e bombas de</p><p>Ca2+ específicas da membrana plasmática e do RE que são responsáveis pela manutenção da baixa concentração</p><p>desse cátion no citoplasma.</p><p>A ação de bombas como a de Na+/K+ ajuda na formação de um gradiente eletroquímico. Esse gradiente tem</p><p>energia potencial que pode ser utilizada para o transporte de solutos contra o seu gradiente de concentração,</p><p>conhecido como transporte ativo secundário. Por meio de um transportador acoplado (cotransportador), o</p><p>movimento espontâneo de um soluto de um meio de maior concentração para aquele de menor concentração</p><p>fornece energia para direcionar o transporte de um segundo soluto contra seu gradiente de concentração. Por</p><p>exemplo, a célula pode utilizar a energia potencial de gradientes de íons, geralmente Na+, mas também de K+ e</p><p>H+, para transportar moléculas e íons através da membrana.</p><p>Figura 4.23 Sequência de eventos no transporte realizado pela bomba Na+/K+ (ATPase) – exemplo</p><p>de transportador antiporte: (1) a proteína transportadora interage com 3 íons Na+ na face</p><p>citoplasmática, causando mudança em sua conformação; (2) essa mudança induz o recrutamento de</p><p>uma molécula de trifosfato de adenosina (ATP), que é hidrolisada. A difosfato de adenosina (ADP) é</p><p>liberada, e o fosfato inorgânico (Pi) continua ligado à proteína transportadora; (3) a hidrólise do ATP</p><p>induz nova mudança conformacional que libera os 3 íons Na+ para o meio extracelular; (4) nessa</p><p>conformação, a proteína transportadora interage com duas moléculas do íon K+. Essa interação libera</p><p>Pi; (5) a proteína agora sofre uma terceira mudança em sua conformação, liberando os 2 K+ para o</p><p>meio intracelular. Note que o transporte ocorre com gasto de energia (uma molécula de ATP).</p><p>O epitélio de revestimento do intestino delgado é um exemplo elucidativo para a compreensão desse tipo de</p><p>transporte ativo secundário. A ingestão de alimentos fornece glicose para o lúmen do intestino delgado, que é</p><p>absorvida pelas células do epitélio e transferida para a corrente sanguínea. O transporte de glicose pela</p><p>membrana plasmática da porção apical das células epiteliais do revestimento intestinal se faz contra o gradiente</p><p>de glicose existente no citoplasma dessas células. Isso é possível porque esse transporte é acoplado ao transporte</p><p>de Na+. A concentração de Na+ no citoplasma das células é muito baixa, e alta no lúmen do intestino. Esse</p><p>acúmulo de Na+ apresenta uma energia potencial para entrar na célula, necessitando apenas de um “caminho”</p><p>pela membrana para que isso aconteça. Desse modo, com um transportador acoplado (só transporta Na+ se</p><p>transportar glicose) do tipo simporte, essa energia dos íons Na+ entrando na célula a favor de seu gradiente</p><p>eletroquímico é utilizada para realizar o cotransporte de glicose para dentro da célula, contra o gradiente de</p><p>concentração de glicose (Figura 4.24).</p><p>Alguns transportes ativos secundários podem ser do tipo antiporte, no qual o íon que é deslocado a favor de</p><p>seu gradiente de concentração fornece a energia para o transporte de outra molécula contra seu gradiente</p><p>eletroquímico. Os dois íons são conduzidos em direções opostas.</p><p>Os meios de transporte discutidos são essenciais para a seletividade das membranas celulares, ou seja, são</p><p>importantes para a manutenção de gradientes de concentração nos diferentes compartimentos. Por sua vez, esses</p><p>gradientes de concentração são importantes para funções específicas dos compartimentos celulares, por exemplo,</p><p>a produção de energia pelas mitocôndrias (ver Capítulo 5) e os potenciais elétricos das membranas. Outro ponto</p><p>importante é que esse transporte também é responsável por importar e exportar moléculas pequenas através da</p><p>membrana, suprindo as necessidades celulares. No Capítulo 15, será abordado com mais detalhes outro tipo de</p><p>transporte realizado pelas membranas, por processos de endocitose e exocitose, que são igualmente importantes e</p><p>estão relacionados ao transporte de grandes quantidades de moléculas.</p><p>Figura 4.24 Transporte transcelular da glicose por células epiteliais do lúmen do intestino delgado</p><p>para a corrente sanguínea. Essas células apresentam, em sua região apical voltada para o lúmen do</p><p>intestino, transportadores de glicose do tipo simporte. Estes levam a glicose para dentro da célula</p><p>contra seu gradiente de concentração, utilizando a energia do gradiente eletroquímico de Na+. A</p><p>entrada do Na+ no citoplasma, a favor de seu gradiente eletroquímico, causa uma modificação na</p><p>conformação da molécula transportadora, que perde sua afinidade para a glicose. A glicose captada</p><p>no lúmen intestinal é liberada no interior da célula; em seguida, difunde-se no citoplasma. Em sua</p><p>membrana basal, existe outro tipo de transportador de glicose que promove a saída passiva da</p><p>glicose para o meio extracelular no sentido da lâmina basal, por difusão facilitada. Do interstício</p><p>intestinal, a glicose alcança capilares sanguíneos para ser distribuída pelo organismo.</p><p>Figura 4.25 Eletromicrografias de transmissão. A. Visão longitudinal de microvilos de células epiteliais</p><p>do intestino delgado (aumento: 25.000×). B. Visão oblíqua de estereocílios das células epiteliais do</p><p>epidídimo. Os estereocílios são flexuosos e, por isso, aparecem em diferentes ângulos (aumento:</p><p>12.000×).</p><p>Transportadores do tipo ABC e resistência a remédios</p><p>Os transportadores do tipo ABC (do inglês ATP-binding cassete) são encontrados nas</p><p>membranas de muitos tipos celulares, e alguns deles têm importante função de eliminação</p><p>de substâncias tóxicas produzidas pelo metabolismo celular. Algumas células cancerígenas</p><p>apresentam grandes quantidades desses transportadores em sua membrana plasmática, o</p><p>que parece estar relacionado com a resistência dessas células a quimioterápicos, sendo então</p><p>conhecidos como transportadores do tipo MDR (do inglês multidrug resistance). Mais</p><p>recentemente observou-se que alguns linfócitos infectados pelo vírus da imunodeficiência</p><p>humana (HIV) podem também apresentar aumento desse tipo de transportador em suas</p><p>membranas, o que poderia estar associado à resistência a agentes antirretrovirais.</p><p>Especializações de membranas plasmáticas: microvilos e estereocílios</p><p>A membrana plasmática pode apresentar projeções sustentadas pelo citoesqueleto. Um exemplo são os</p><p>microvilos do epitélio do intestino delgado e de túbulos renais de mamíferos. Essas células são colunares ou</p><p>cúbicas, dispostas em camada única e suas superfícies na região apical apresentam numerosas projeções</p><p>digitiformes – os microvilos (Figura 4.25). Cada microvilo, ou microvilosidade, é uma projeção da membrana e</p><p>do citoplasma. Sua estrutura é mantida por numerosos feixes de microfilamentos de actina.</p><p>Os microvilos do epitélio intestinal são paralelos uns aos outros e formam uma camada muito regular na</p><p>superfície intestinal (borda estriada) visível ao microscópio óptico. No intestino, a função dos microvilos é</p><p>aumentar a área da superfície de membrana direcionada para o lúmen intestinal. Os microvilos dessas células</p><p>aumentam a velocidade de transporte dos nutrientes para dentro das células. Além de aumentarem a superfície</p><p>que, após o surgimento do RNA, há evidências da</p><p>ocorrência do ácido desoxirribonucleico (DNA), formado pela polimerização de desoxiribonucleotídios sobre um</p><p>molde de RNA. Esses dois tipos de ácidos nucleicos passaram a definir os tipos de proteínas a serem sintetizadas.</p><p>Considerando a enorme variedade de proteínas celulares, formadas por 20 monômeros diferentes (os 20</p><p>aminoácidos), é pouco provável que todas tenham se formado por acaso. A síntese das proteínas deve ter tido</p><p>ácidos nucleicos como molde inicial. Depois desse processo, as proteínas, ou polipeptídios, sofrem dobramentos</p><p>nas três dimensões, resultando em domínios estruturais. Como essa estrutura é essencial para a sua função, o</p><p>processo de dobramento em si também é importante, mantendo os domínios e assegurando a permanência dos</p><p>organismos nos diferentes ambientes, ou seja, conferindo-lhes maior valor adaptativo.</p><p>As primeiras células, formadas por agregados de ácidos nucleicos e envoltas por membranas de fosfolipídios,</p><p>eram procariontes e heterotróficas, ou seja, não eram autossuficientes, pois dependiam da disponibilidade de</p><p>nutrientes e não eram capazes de sintetizar seus alimentos. A escassez de recursos diminuiu a capacidade de</p><p>reprodução e a geração de descendentes desses organismos. Essas primeiras células eram também anaeróbias,</p><p>pois não existia oxigênio na atmosfera.</p><p>A manutenção da vida na Terra dependia, então, do aparecimento das primeiras células autotróficas</p><p>fotossintetizantes (ou fototróficas), ou seja, capazes de sintetizar moléculas complexas a partir de substâncias</p><p>muito simples e da energia solar. Um sistema capaz de utilizar a energia do Sol e armazená-la em ligações</p><p>químicas surgiu, muito provavelmente, em organismos procariontes semelhantes às “algas azuis” ou cianofíceas.</p><p>A partir desse sistema, ocorreu a síntese de nutrientes e a liberação de oxigênio. Esse processo marcou o</p><p>surgimento da fotossíntese, que depende de pigmentos celulares específicos como, por exemplo, a clorofila</p><p>(pigmento de cor verde), que capta as radiações azul e vermelha da luz do Sol e utiliza essa energia para ativar</p><p>processos sintéticos. O oxigênio liberado pela fotossíntese realizada pelas bactérias autotróficas acumulou-se e</p><p>foi alterando a atmosfera. As moléculas do gás oxigênio (O2) difundiram-se para níveis mais elevados da</p><p>atmosfera, onde se romperam sob ação da radiação ultravioleta, originando átomos de oxigênio. Muitos destes</p><p>combinaram-se para formar ozônio (O3), que tem grande capacidade de absorver a radiação ultravioleta. Essa</p><p>propagação de ondas pode acarretar efeitos críticos em biomoléculas, provocando alterações em ligações</p><p>químicas e, no caso do DNA, podendo alterar a cadeia de nucleotídios. Desse modo, a formação de uma camada</p><p>de ozônio foi importante para proteger a superfície da Terra da radiação ultravioleta, mas possibilitando a</p><p>passagem de luz visível. O início da fotossíntese e as modificações da atmosfera foram de grande importância</p><p>para a evolução das células e das formas de vida existentes na Terra. As bactérias anaeróbias ficaram restritas a</p><p>nichos especiais, onde não existe oxigênio.</p><p>O aparecimento das membranas dentro das células deu origem às células eucariontes. Invaginações da</p><p>membrana plasmática, iniciadas por proteínas contráteis presentes no citoplasma, culminaram no elaborado</p><p>sistema interno de membranas. Essa hipótese é apoiada pela observação de que as membranas intracelulares</p><p>mantêm, aproximadamente, a mesma assimetria que existe na membrana plasmática (ver Capítulo 4). A face das</p><p>membranas internas que está em contato com o citoplasma (matriz citoplasmática) assemelha-se à face interna da</p><p>membrana plasmática. O mesmo acontece com aquela voltada para o interior dos compartimentos intracelulares,</p><p>que tem semelhança com a face externa da membrana plasmática (Figura 1.4). A interiorização da membrana foi</p><p>fundamental para a evolução das células eucariontes, pois formou muitos compartimentos intracelulares nos</p><p>quais se concentram enzimas e substratos envolvidos nos mesmos processos. Essas membranas proporcionaram a</p><p>separação e a delimitação de microambientes dentro da célula, isolaram compartimentos e criaram uma barreira</p><p>seletiva para passagem de substâncias entre as organelas e o citoplasma (ver Figura 1.4).</p><p>Os compartimentos intracelulares envoltos por membrana são definidos como organelas. Entre estes estão o</p><p>núcleo, o retículo endoplasmático, o complexo de Golgi, os lisossomos, as mitocôndrias e os peroxissomos. Os</p><p>endossomos são compartimentos intracelulares temporários. A compartimentalização intracelular separa a célula</p><p>em microrregiões com composição e concentração específica de enzimas com funções relacionadas. Essa</p><p>separação molecular e funcional aumentou muito a eficiência dos processos celulares e promoveu reações mais</p><p>elaboradas, aumentando também a complexidade dos organismos.</p><p>Figura 1.4 Desenho fundamentado principalmente nos trabalhos de C. de Duve, que mostra a</p><p>maneira como, provavelmente, se constituíram as primeiras células eucariontes. A</p><p>compartimentalização intracelular surgiu por meio de invaginações da membrana plasmática,</p><p>envolvendo o ácido desoxirribonucleico (DNA) no núcleo, e criando outras organelas</p><p>compartimentalizadas. Essa hipótese é apoiada pela observação de que as membranas intracelulares</p><p>apresentam constituição molecular muito semelhante à da membrana plasmática.</p><p>Origem das mitocôndrias</p><p>Há evidências sugerindo que as organelas envolvidas nas transformações energéticas, como as mitocôndrias,</p><p>originaram-se de bactérias que foram fagocitadas, escaparam dos mecanismos de digestão intracelular e</p><p>estabeleceram-se como simbiontes (endossimbiontes) nas células eucariontes hospedeiras, criando um</p><p>relacionamento mutuamente benéfico (Figura 1.5).</p><p>Ao longo da evolução, as mitocôndrias evoluíram com a célula hospedeira, tornando-se dependentes do DNA</p><p>dos cromossomos dessas células para sua manutenção. A maioria das proteínas das mitocôndrias é codificada por</p><p>genes contidos no núcleo celular, sendo sintetizadas nos ribossomos do citoplasma e, depois, transferidas para</p><p>dentro das mitocôndrias.</p><p>Figura 1.5 Desenho esquemático que mostra a teoria da origem bacteriana das mitocôndrias por</p><p>endossimbiose. Células eucariontes anaeróbias, primitivas (membrana em azul), teriam fagocitado</p><p>bactérias aeróbias (membrana em vermelho), as quais escaparam à digestão intracelular e</p><p>estabeleceram inter-relações mutuamente úteis com as células hospedeiras, que, por sua vez,</p><p>tornaram-se aeróbias. Ao mesmo tempo, as bactérias, entre outras vantagens, receberam proteção e</p><p>alimentação em sua nova localização no citoplasma da célula hospedeira. Note que, por conta de sua</p><p>origem, as mitocôndrias têm dupla membrana (em azul e vermelho).</p><p>A existência de DNA mitocondrial e de um código genético mitocondrial distinto do nuclear, o fato de</p><p>mitocôndrias reproduzirem-se por divisão a partir de outras mitocôndrias e a semelhança entre os mecanismos de</p><p>fissão mitocondrial e de divisão de bactérias sugerem que as mitocôndrias se originaram de bactérias que</p><p>invadiram uma outra célula. Os ribossomos das mitocôndrias são semelhantes aos das bactérias. O DNA das</p><p>mitocôndrias e das bactérias codifica RNA mensageiro (mRNA) sem íntrons, diferente dos eucariotos. Os</p><p>ribossomos mitocondriais são diferentes dos citosólicos em tamanho, composição de RNA e proteínas, e também</p><p>na sensibilidade aos antibióticos. O cloranfenicol, por exemplo, inibe a síntese de proteínas tanto nas</p><p>mitocôndrias como nas bactérias, mas não nos ribossomos do citoplasma em eucariotos. Estudos de genes</p><p>mitocondriais presentes nos eucariotos atuais indicam que todos descendem de um organismo em que essa</p><p>endossimbiose que gerou as mitocôndrias ocorreu uma única vez, fornecendo vantagens tanto para a bactéria,</p><p>que recebeu proteção e nutrientes, quanto para a célula hospedeira, que ganhou um sistema mais eficiente de</p><p>aproveitamento de energia, pela fosforilação oxidativa.</p><p>Acredita-se que essa aquisição da fosforilação oxidativa foi essencial</p><p>celular, como discutido anteriormente, apresentam proteínas de membrana com atividade enzimática,</p><p>responsáveis pela etapa final da digestão de carboidratos (dissacaridases) e proteínas (dipeptidases).</p><p>Posteriormente, os nutrientes passam das células para o tecido conjuntivo subjacente ao epitélio e, daí, para os</p><p>vasos sanguíneos e linfáticos, distribuindo-se, então, por todo o organismo.</p><p>Nos rins, os microvilos são encontrados na superfície livre da camada única de células cúbicas que revestem</p><p>os túbulos contorcidos proximais. Pelo lúmen desses túbulos, passa um filtrado do plasma sanguíneo que origina</p><p>a urina, mas que ainda contém muitas moléculas aproveitáveis. Nos túbulos contorcidos proximais, muitas dessas</p><p>moléculas são removidas do filtrado, passando para as células dos túbulos, de onde são posteriormente</p><p>devolvidas ao sangue. Os microvilos dessas células são também organizados paralelamente entre si, formando</p><p>uma borda estriada visível ao microscópio óptico.</p><p>A maioria das células têm microvilos, embora não tão numerosos e organizados como os das células</p><p>exemplificadas anteriormente. Os microvilos encontrados nas células em geral são pequenos e irregulares,</p><p>contêm menor número de filamentos e se distribuem irregularmente por toda a superfície celular. Microvilos</p><p>individuais só podem ser diferenciados por microscópio eletrônico.</p><p>Outro exemplo de prolongamento de membrana são os estereocílios: expansões longas e filiformes da</p><p>superfície livre de determinadas células epiteliais (ver Figura 4.25). São flexíveis, mas incapazes de movimentar-</p><p>se. Os estereocílios diferem dos microvilos por serem mais longos e ramificados; são encontrados em células da</p><p>orelha interna e do epidídimo.</p><p>Reconhecimento, adesão e junção entre células</p><p>Moléculas de adesão celular no câncer</p><p>Quando as células normais se transformam em células malignas, perdem a adesividade,</p><p>separando-se umas das outras. As células malignas soltas são transportadas pelo sangue ou</p><p>pela linfa e transforma-se em tumores a distância – as metástases. Mesmo as moléculas de</p><p>adesão celular (CAM) normais podem participar de processos patológicos. Um exemplo é a</p><p>afinidade do vírus da poliomielite pelos neurônios (esse vírus se liga a CAM de neurônios e,</p><p>assim, penetra nessas células).</p><p>Os componentes da membrana celular também permitem que as células se reconheçam mutuamente e</p><p>estabeleçam conexões transientes ou duradouras entre si. O reconhecimento e a adesão entre as células</p><p>acontecem por meio de glicoproteínas transmembranar, como as CAMs (do inglês cell adhesion molecules). As</p><p>células permanecem unidas umas às outras e à matriz extracelular, devido a estruturas juncionais, que podem ser</p><p>divididas em três grupos: (1) estruturas cuja função principal é unir fortemente as células umas às outras ou à</p><p>matriz extracelular (desmossomos e junções aderentes); (2) estrutura que promove a vedação entre as células</p><p>(zônula oclusiva); e (3) estrutura que estabelece comunicação entre uma célula e outra (nexos, junção</p><p>comunicante ou gap junction).</p><p>Essas estruturas são importantes para formação de tecidos, possibilitando maior comunicação celular, assim</p><p>como a compartimentalização de órgãos e tecidos em metazoários. Esses assuntos serão discutidos com mais</p><p>detalhes no Capítulo 8.</p><p>Síntese e reciclagem de membranas celulares</p><p>O crescimento das membranas celulares acontece por adição de novos componentes fornecidos pelo RE (ver</p><p>Capítulo 14). Essas novas regiões de membrana são entregues a outras organelas e à membrana plasmática (ver</p><p>Capítulos 14 e 15). Note que não existe nova formação de membranas, e sim incorporação de novas regiões a</p><p>membranas preexistentes.</p><p>Os lipídios são sintetizados no RE liso e a transferência das moléculas lipídicas ocorre por mais de um</p><p>mecanismo. Entre as membranas do RE liso e RE rugoso há uma difusão, devido à interação física entre essas</p><p>duas organelas. Esses lipídios podem também ser transferidos por meio de vesículas que se destacam do RE e são</p><p>transportadas para outros compartimentos, por proteínas motoras que se deslocam sobre o citoesqueleto. Essas</p><p>vesículas fundem-se, então, com os compartimentos-alvo (ver Capítulo 15). Outro modo de transferência ocorre</p><p>em locais onde a membrana do RE está ligada à membrana de outras organelas por proteínas específicas. Essa</p><p>interação possibilita a troca direta de lipídios entre essas regiões de membrana (ver Capítulo 14). Um exemplo é</p><p>o transporte de moléculas de fosfolipídios da membrana do RE liso para a membrana de mitocôndrias.</p><p>É importante notar que a diferença da constituição das duas faces da membrana é mantida nesse transporte,</p><p>como discutido anteriormente, ou seja, glicoproteínas e glicolipídios compõem somente a face não</p><p>citoplasmática das membranas celulares (ver Figura 4.10).</p><p>Além da movimentação das novas moléculas sintetizadas, existe uma reciclagem de moléculas da membrana</p><p>plasmática. Ao internalizar algum conteúdo extracelular, por meio da endocitose, uma parte da membrana</p><p>também é internalizada (ver Capítulo 15). Nessa internalização, as moléculas que estavam na membrana</p><p>plasmática passam a pertencer à vesícula. Essas moléculas podem voltar à membrana plasmática, isto é, elas</p><p>podem ser recicladas. Há um fluxo de moléculas transportadas por vesículas nos dois sentidos: da membrana</p><p>plasmática para o interior da célula e de compartimentos citoplasmáticos para a membrana plasmática (ver</p><p>Capítulo 15). Isso mostra que a manutenção de membranas não ocorre somente pela síntese de novos</p><p>componentes, mas também pela reciclagem de componentes preexistentes.</p><p>Bibliografia</p><p>Alberts B, Johnson A, Lewis J et al. Molecular Biology of the Cell. 3rd ed. New York: Garland Press; 1994.</p><p>Bennet V. The membrane skeleton of human erythrocytes and its implications for more complex cells. Ann Rev Biochem. 1985;54:273.</p><p>Beyer EC. Gap junctions. Int Rev Cytol. 1993;137C:1-37.</p><p>Bock G, Clark S (eds.). Junctional complexes of epithelial cells. Ciba Symposium 125. John Wiley; 1987.</p><p>Bretscher MS. Endocytosis: relation to capping and cell locomotion. Science. 1984;224:681.</p><p>Bretscher MS. Membrane structure: some general principles. 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Sabe-se atualmente que essas estruturas</p><p>não somente podem ter formatos variados (desde pequenos grânulos até longos filamentos), mas também</p><p>apresentam funções celulares muito diferentes e abrangentes, incluindo a metabolização de todos os principais</p><p>grupos de nutrientes da dieta e constituindo a principal fonte de energia química – a molécula de trifosfato de</p><p>adenosina (ATP).</p><p>Estrutura das mitocôndrias</p><p>As mitocôndrias apresentam duas membranas (interna e externa) que, como as demais membranas celulares, são</p><p>bicamadas de fosfolipídios, contendo pequenas quantidades de outros lipídios, além de proteínas de membrana.</p><p>A membrana mitocondrial externa (Figura 5.1) separa as mitocôndrias do citoplasma, é predominantemente lisa e</p><p>pode se ligar fisicamente a membranas de outras organelas (como o retículo endoplasmático). A membrana</p><p>mitocondrial externa é permeável a diferentes tipos de moléculas com massa inferior a 5 kDa. Essa</p><p>permeabilidade se deve a proteínas específicas dessa membrana, as voltage-dependent anion channels (VDACs;</p><p>em português, canais aniônicos dependentes de voltagem), que formam canais nessas membranas e promovem a</p><p>passagem dessas moléculas.</p><p>A membrana mitocondrial externa liga-se fisicamente à interna em alguns pontos específicos, conhecidos</p><p>como sítios de contato, mas, na maior parte da organela, as duas são separadas por um pequeno espaço conhecido</p><p>como espaço intermembranas mitocondrial. Embora pequeno em volume, esse espaço tem características</p><p>funcionais distintas do restante da mitocôndria e importante papel na regulação da morte celular, como abordado</p><p>adiante.</p><p>A membrana mitocondrial interna também é formada por fosfolipídios, mas tem cerca de 75% da sua massa</p><p>composta por proteínas de membrana, sendo, portanto, predominantemente proteica. Nesse sentido, essa</p><p>membrana difere da maioria das membranas celulares, em que predomina o conteúdo de lipídios. Essa membrana</p><p>apresenta numerosas dobras voltadas para o interior da organela – as cristas mitocondriais – que aumentam a</p><p>sua área de superfície. Esse aumento da superfície promovido pelas cristas é importante para a realização de</p><p>fosforilação oxidativa (ou a síntese de ATP com alta eficiência) na organela, que ocorre na membrana interna.</p><p>Ao contrário da membrana mitocondrial externa, a membrana interna tem muito baixa permeabilidade a</p><p>componentes celulares, e as moléculas que passam por ela o fazem através de proteínas transportadoras</p><p>específicas.</p><p>A baixa permeabilidade da membrana mitocondrial interna é mediada, pelo menos em parte, pela</p><p>cardiolipina, que é um fosfolipídio específico da membrana interna que tem quatro cadeias carbônicas em sua</p><p>estrutura (enquanto a maioria deles tem duas cadeias), garantindo a exclusão até mesmo de íons muito pequenos,</p><p>como H+ (prótons). Essa impermeabilidade a prótons das mitocôndrias é essencial para sua produção de ATP e</p><p>será abordada adiante. A enzima que produz a maior parte do ATP na mitocôndria – a ATP-sintase – localiza-se</p><p>principalmente nas pontas das cristas.</p><p>Figura 5.1 Eletromicrografia de uma mitocôndria de célula renal. Note a membrana externa, a</p><p>membrana interna, o espaço intermembranas e as cristas, que são dobramentos da membrana</p><p>interna. A matriz, de aspecto granular e denso, preenche o espaço entre as cristas.</p><p>A membrana interna mitocondrial delimita o espaço interior da organela – a matriz mitocondrial –, que tem</p><p>aspecto denso e granular à microscopia eletrônica de transmissão. Essa matriz apresenta alto conteúdo de</p><p>proteínas, dentre elas enzimas que metabolizam piruvato, aminoácidos e ácidos graxos (Figura 5.2). A matriz</p><p>mitocondrial também contém ácido desoxirribonucleico (DNA) mitocondrial, ribossomos, transportadores e</p><p>mensageiros de ácido ribonucleico transportador (tRNA e mRNA, respectivamente).</p><p>Estudos científicos foram facilitados por métodos de separação</p><p>A análise da localização e da função de componentes das mitocôndrias é realizada por diferentes métodos: (1) in</p><p>vivo (em culturas de células ou em animais intactos); (2) in situ, em células com a membrana plasmática</p><p>permeabilizada, em que as mitocôndrias se mantêm na sua localização normal devido à manutenção do</p><p>citoesqueleto; e (3) in vitro, em que mitocôndrias podem ser separadas do restante da célula (Figura 5.3).</p><p>Para isolar mitocôndrias ou outras organelas, a membrana celular e o citoesqueleto são rompidos, mecânica</p><p>ou enzimaticamente (ver Capítulo 2). O homogenato obtido é então submetido a um processo de centrifugação</p><p>diferencial. Mitocôndrias isoladas também podem ser processadas para separar os seus diferentes</p><p>compartimentos, como demonstrado na Figura 5.3. As organelas podem ser rompidas com detergentes ou</p><p>ultrassom e seus componentes, separados (membrana interna, membrana externa, espaço intermembranas e</p><p>matriz).</p><p>O estudo dessas frações demonstrou que a matriz apresenta alta concentração de proteínas, incluindo as</p><p>enzimas do ciclo do ácido cítrico, β-oxidação de ácidos graxos e enzimas da replicação, transcrição e tradução do</p><p>DNA mitocondrial (conforme será abordado a seguir). A membrana mitocondrial interna é a membrana celular</p><p>mais rica em proteínas, compreendendo proteínas que constituem a cadeia transportadora de elétrons, a ATP-</p><p>sintase e proteínas que transportam substratos e íons através da membrana.</p><p>Morfologia e dinâmica mitocondriais</p><p>O volume total das mitocôndrias somadas em uma célula geralmente compreende 20 a 25% do espaço dessas</p><p>células em humanos.</p><p>Embora a estrutura mitocondrial descrita anteriormente seja mantida, o formato das</p><p>mitocôndrias é extremamente variável. Essas organelas variam de pequenos grânulos com 200 nm (nanômetros)</p><p>de diâmetro a fibras com mais de 30 μm (micrômetros) de comprimento. As mitocôndrias são altamente</p><p>dinâmicas, movimentando-se na célula e mudando de formato constantemente ao longo do tempo, por processos</p><p>de fissão (quando uma mitocôndria se divide em duas) e fusão (quando duas mitocôndrias se juntam e se tornam</p><p>uma). Esses processos ocorrem constantemente e são importantes para manter a função das mitocôndrias, sua</p><p>distribuição nas células e também para renovar seus componentes, como observado adiante. Tanto a morfologia</p><p>mitocondrial quanto suas mudanças dinâmicas no tempo podem ser observadas por microscopia de fluorescência,</p><p>corando as organelas com reagentes que fluorescem (Figura 5.4).</p><p>Figura 5.2 Componentes mitocondriais e suas funções.</p><p>Figura 5.3 Métodos utilizados para fracionar mitocôndrias. O fracionamento mitocondrial é possível</p><p>porque a membrana mitocondrial externa é muito mais sensível a detergentes e ao ultrassom do que</p><p>a interna. Na primeira etapa, apenas a membrana mitocondrial externa é rompida, conservando-se</p><p>íntegra a membrana interna, que retém a matriz mitocondrial. Posteriormente, a ruptura da membrana</p><p>interna, devido a novo tratamento com detergente, possibilita a obtenção dessa membrana e da</p><p>matriz mitocondrial em frações separadas. O processo completo separa quatro frações: a membrana</p><p>interna, a matriz, a membrana externa e o conteúdo do espaço intermembranas.</p><p>As mitocôndrias deslocam-se (trafegam) pelo ambiente intracelular. Esses movimentos são importantes para</p><p>transportá-las a locais onde há alta demanda por ATP (tipicamente aqueles com maior massa mitocondrial). A</p><p>movimentação mitocondrial também atua na manutenção de uma população saudável, com proteínas funcionais.</p><p>Para que possam se movimentar pela célula, mitocôndrias são atracadas a microtúbulos celulares (Figura</p><p>5.5). O movimento anterógrado, ou movimento de mitocôndrias da área mais central da célula (próxima ao</p><p>núcleo) para a periferia, ocorre por meio da cinesina KIF5, que se liga a um complexo de proteínas (Milton e</p><p>Miro) ligadas à superfície externa da membrana externa mitocondrial. Essa cinesina promove o movimento</p><p>anterógrado das mitocôndrias. Desliza de modo dependente do consumo de ATP, pelos microtúbulos (ver</p><p>Capítulo 7). Em alguns casos, como dos neurônios, as distâncias percorridas por mitocôndrias em movimento</p><p>anterógrado são enormes. Por exemplo, o axônio do nervo ciático tem cerca de 1 m de comprimento e as</p><p>mitocôndrias são movimentadas por toda sua extensão. As mitocôndrias também possuem movimento</p><p>retrógrado, da periferia da célula para o centro. Esse movimento é controlado por dineínas, que funcionam de</p><p>maneira semelhante às cinesinas, consumindo ATP para movimentar as mitocôndrias em direção ao centro da</p><p>célula.</p><p>Figura 5.4 A morfologia das mitocôndrias é variada. Células de fígado observadas em microscópio de</p><p>fluorescência, com mitocôndrias coradas. Percebe-se que as células à esquerda têm mitocôndrias</p><p>mais alongadas e fusionadas, e as células da direita apresentam mitocôndrias menores e mais</p><p>fragmentadas. A barra de escala nos cantos superiores corresponde a 5 μm. (Microscopia: Dr.</p><p>Pâmela A. Kakimoto.)</p><p>Figura 5.5 Mecanismos de tráfego mitocondrial. As mitocôndrias são ancoradas a microtúbulos do</p><p>citoesqueleto. A cinesina KIF5, que se liga às mitocôndrias por meio das proteínas Milton e Miro,</p><p>realiza o transporte anterógrado dessas organelas em direção à periferia da célula. Esse movimento é</p><p>típico de mitocôndrias com proteínas recém-formadas e leva essas organelas para áreas de alto</p><p>consumo de ATP na célula. Dineínas, que possivelmente também se ligam à mitocôndria por meio</p><p>das proteínas Milton e Miro, são responsáveis pelo movimento retrógrado em direção ao núcleo</p><p>celular. Esse movimento tipicamente remove da periferia mitocôndrias com lesões em seus</p><p>componentes.</p><p>De modo geral, nota-se que mitocôndrias contendo proteínas recém-formadas são transportadas por</p><p>movimento anterógrado, para popular a periferia celular com organelas novas. Por outro lado, mitocôndrias</p><p>contendo proteínas com modificações que podem comprometer sua função são transportadas por movimento</p><p>retrógrado para a proximidade do núcleo, onde podem ser degradadas por mecanismos que veremos adiante.</p><p>A predominância de mitocôndrias alongadas ou fragmentadas em uma célula será determinada pelo</p><p>equilíbrio entre os processos de fusão e fragmentação mitocondrial. O processo de fusão mitocondrial é iniciado</p><p>quando duas mitocôndrias se aproximam de ponta a ponta durante seu transporte. Proteínas denominadas</p><p>“mitofusinas” aproximam-se e ancoram as membranas externas de duas mitocôndrias (Figura 5.6). Essas</p><p>proteínas promovem a fusão das membranas externas das duas mitocôndrias, utilizando a energia liberada pela</p><p>conversão de guanosina-trifosfato (GTP) em guanosina-difosfato (GDP) e Pi (fosfato livre). Então a OPA1, uma</p><p>enzima que quebra GTP (GTPase), promove a fusão das membranas internas das duas mitocôndrias,</p><p>promovendo a troca de material da matriz mitocondrial.</p><p>A fissão mitocondrial ocorre por mecanismo mediado por DRP1, também uma GTPase, que se polimeriza</p><p>em forma de anel em torno da membrana externa, e promove a constrição e a separação em duas mitocôndrias.</p><p>Esse processo também depende do consumo de GTP. O fracionamento da membrana interna durante a fissão</p><p>mitocondrial ocorre por mecanismos que ainda estão sendo elucidados. É interessante notar que esse mecanismo</p><p>se assemelha muito ao processo de divisão de uma bactéria em duas, uma das várias evidências que indicam que</p><p>a mitocôndria tem origem bacteriana, como apresentado no Capítulo 1.</p><p>Os processos de tráfego associados à fissão e à fusão mitocondrial fazem com que as mitocôndrias de uma</p><p>determinada célula renovem seu conteúdo continuamente, incluindo troca de lipídios e proteínas de membrana e</p><p>componentes da matriz e espaço intermembranas. Desse modo, as mitocôndrias de uma célula não se comportam</p><p>como organelas individuais, mas, sim, como uma rede dinâmica e plástica. Um dos componentes mitocondriais</p><p>importantes que é trocado durante esses processos dinâmicos é o DNA mitocondrial.</p><p>DNA mitocondrial</p><p>Em animais, a mitocôndria é a única estrutura, exceto o núcleo, na qual se encontram moléculas de DNA. O</p><p>DNA mitocondrial (Figura 5.7) é circular, está presente em centenas ou até milhares de cópias por célula, se</p><p>replica de modo independente do DNA nuclear e possui 16.568 pares de bases em humanos. Codifica 13 cadeias</p><p>polipeptídicas de componentes da fosforilação oxidativa, além de 22 RNAs transportadores e 2 RNAs</p><p>ribossômicos necessários para produzir as 13 cadeias polipeptídicas. O genoma mitocondrial é muito compacto e</p><p>não apresenta íntrons. Possui dupla fita e, ao contrário do DNA nuclear, ambas as fitas são transcritas. No</p><p>genoma mitocondrial, 4 dos 64 códons usados são diferentes do código genético universal de eucariotos, sendo</p><p>semelhantes ao das bactérias.</p><p>Uma peculiaridade do DNA mitocondrial é sua origem exclusivamente materna. As mitocôndrias do</p><p>organismo originam-se daquelas provenientes do óvulo, sem participação das que procedem do espermatozoide.</p><p>Essa característica possibilita estudar linhagens evolutivas maternas. A partir desses dados, atualmente se sabe</p><p>que os seres humanos descenderam de uma única mulher, conhecida como “Eva mitocondrial” que viveu na</p><p>África há cerca de 200 mil anos.</p><p>Figura 5.6 Processos de fusão e fissão das mitocôndrias. Na fusão mitocondrial, duas mitocôndrias</p><p>são ancoradas por proteínas da membrana mitocondrial externa – as mitofusinas. Ocorre, então,</p><p>fusão da membrana interna, mediada pela OPA1, gerando uma mitocôndria de maior volume. Na</p><p>fissão mitocondrial, ocorre a separação da membrana interna por mecanismos ainda não elucidados.</p><p>A separação da membrana externa ocorre por polimerização da proteína DRP1 em forma de anel em</p><p>torno</p><p>da mitocôndria, promovendo constrição da organela e dividindo-a em duas mitocôndrias</p><p>menores.</p><p>Figura 5.7 Eletromicrografias de moléculas circulares de ácido desoxirribonucleico (DNA), isoladas de</p><p>mitocôndrias de fibroblastos de camundongo. (Cortesia de M.M.K. Nass.)</p><p>Mutações pontuais no DNA mitocondrial que não causam prejuízo de função ocorrem na velocidade de</p><p>aproximadamente 1 base a cada 3.500 anos. Essa taxa de mutação é cerca de 10 vezes maior que a do DNA</p><p>nuclear. Essa diferença ocorre porque o DNA mitocondrial se encontra mais próximo a uma fonte importante de</p><p>radicais livres. Radicais livres são compostos químicos altamente reativos que alteram estruturas das</p><p>biomoléculas (como veremos adiante). Além disso, as mitocôndrias carecem de histonas protetoras e seus</p><p>mecanismos de reparo de DNA são menos eficientes. Assim, essas mudanças acumulam-se no DNA</p><p>mitocondrial com o tempo. Cientificamente, o mapeamento dessas mutações mitocondriais em populações</p><p>humanas nos possibilita inferir o padrão de suas migrações ao longo da História.</p><p>Os 13 polipeptídios gerados com informações do genoma mitocondrial constituem menos de 1% do total de</p><p>proteínas de uma mitocôndria, que se estima possuir cerca de 1.500 polipeptídios distintos. A maioria das</p><p>proteínas da mitocôndria é produzida no citoplasma, a partir de informações do genoma nuclear, e importada</p><p>para a organela. Os 13 polipeptídios que são codificados pelo genoma mitocondrial são parte dos complexos</p><p>proteicos da membrana mitocondrial interna.</p><p>Biogênese e degradação de componentes mitocondriais</p><p>A massa mitocondrial de uma célula precisa ser cuidadosamente regulada. Se faltar atividade mitocondrial, pode</p><p>haver falência da manutenção dos níveis de ATP intracelulares e, consequentemente, redução de atividades</p><p>bioquímicas básicas. Em contrapartida, o excesso de massa mitocondrial pode produzir radicais livres em</p><p>demasia, o que também prejudica a célula porque danifica seus componentes bioquímicos. Desse modo, a</p><p>regulação da síntese de componentes mitocondriais, ou biogênese mitocondrial, é essencial.</p><p>A gênese de novas proteínas mitocondriais é coordenada por proteínas nucleares da família PGC-1</p><p>(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1) que ativam fatores de transcrição. Como</p><p>consequência, ocorre a expressão de proteínas mitocondriais codificadas no núcleo e na mitocôndria, além da</p><p>duplicação do DNA mitocondrial. Em virtude disso, há aumento coordenado de produção de proteínas</p><p>mitocondriais no citoplasma e na mitocôndria, e da quantidade de cópias de DNA mitocondrial. PGC-1 é ativada</p><p>em variadas situações, incluindo exercício físico e baixos níveis de ATP intracelular. Nessas situações, os níveis</p><p>de monofosfato de adenosina (AMP) elevam-se, ativando a AMPK, uma quinase sensível a AMP.</p><p>Os fosfolipídios das membranas mitocondriais são sintetizados no retículo endoplasmático e podem ser</p><p>modificados na mitocôndria. As moléculas de fosfolipídios são transferidas para as mitocôndrias por proteínas</p><p>transportadoras e em pontos de contato físico entre as duas organelas. Em microscopias eletrônicas, a membrana</p><p>do retículo e a membrana mitocondrial externa são frequentemente observadas em contato, uma característica</p><p>importante não somente para a obtenção de fosfolipídios mitocondriais, mas também para a regulação dos níveis</p><p>de cálcio intracelulares, como será abordado adiante.</p><p>As mitocôndrias apresentam alguns sistemas de reparo de seu DNA, embora os mecanismos tenham menos</p><p>componentes que os do DNA nuclear. Possuem proteases capazes de degradar e eliminar proteínas danificadas.</p><p>Além disso, um mecanismo importante de manutenção da população mitocondrial saudável é a eliminação</p><p>seletiva de mitocôndrias com danos, por meio da mitofagia (Figura 5.8), um tipo especializado de autofagia.</p><p>A mitofagia necessita de mitocôndrias fragmentadas e pequenas para ocorrer, e, portanto, está intimamente</p><p>associada à fissão mitocondrial induzida pela DRP1. Após a fragmentação mitocondrial, mitocôndrias pequenas</p><p>e com baixo gradiente de prótons transmembrana, uma indicação de baixa função (conforme abordado adiante),</p><p>acumulam uma quinase denominada “PINK1” na sua membrana externa. Esse acúmulo recruta uma outra</p><p>proteína, a Parkina, que marca a mitocôndria com cadeias contendo várias moléculas de ubiquitina, isso é, uma</p><p>cadeia de poliubiquitina. Essas cadeias sinalizam que um componente celular está danificado e precisa ser</p><p>degradado. No caso particular da mitocôndria, a resposta celular à poliubiquitina é a formação de uma membrana</p><p>dupla de um autofagossomo em torno da mitocôndria danificada. Esse autofagossomo posteriormente se funde a</p><p>um lisossomo, que contém enzimas líticas que quebram e degradam proteínas, lipídios e DNA da mitocôndria</p><p>danificada, eliminando-a.</p><p>Como há muitas mitocôndrias em cada célula, e essas dinamicamente trocam material por meio de fusão e</p><p>fissão, a ocorrência de mitofagia seletivamente elimina componentes disfuncionais de toda a massa mitocondrial</p><p>(a mitofagia ocorre principalmente em mitocôndrias com componentes menos funcionais – membranas, proteínas</p><p>e DNA – identificados por mecanismos ainda pouco conhecidos). Nesse processo de mitofagia, eliminam-se</p><p>mitocôndrias que contêm DNAs danificados, agindo, portanto, como um mecanismo de preservação da</p><p>integridade da população de DNA mitocondrial da célula. O balanço entre biogênese mitocondrial e a eliminação</p><p>de componentes defeituosos é mantido constante em células sadias, garantindo uma população mitocondrial</p><p>saudável.</p><p>Figura 5.8 A mitofagia elimina mitocôndrias disfuncionais. A fragmentação mitocondrial produz</p><p>mitocôndrias menores, algumas das quais podem apresentar baixa função. Essas mitocôndrias têm</p><p>dificuldade em importar a PINK1 corretamente, que se acumula na membrana externa. Esse acúmulo</p><p>recruta a proteína Parkina para a mitocôndria e promove a poliubiquitinação de proteínas na</p><p>superfície da membrana externa. Há formação da membrana dupla do autofagossomo em torno da</p><p>mitocôndria danificada, que se funde ao lisossomo. Este degrada e elimina a mitocôndria danificada</p><p>com suas enzimas líticas.</p><p>Origem e funções das mitocôndrias</p><p>Transformação de energia</p><p>A energia utilizada pelas células eucarióticas para realizar suas atividades provém da ruptura de ligações</p><p>covalentes de moléculas de compostos orgânicos ricos em energia. Os seres vivos comem e armazenam grande</p><p>variedade de moléculas grandes que contêm energia química em suas ligações covalentes. Também produzem</p><p>moléculas complexas constantemente, um processo que só é termodinamicamente viável se acoplado à quebra de</p><p>ligações químicas com quantidade equivalente ou superior de energia. A “moeda energética” universal que</p><p>promove as reações de síntese é a molécula de trifosfato de adenosina (ATP), que apresenta duas ligações do tipo</p><p>fosfoanidrido (Figura 5.9), que, quando quebradas, liberam quantidades grandes de energia.</p><p>Figura 5.9 Fórmula da trifosfato de adenosina (ATP). O símbolo ~ indica as ligações químicas do tipo</p><p>fosfoanidrido, que são ricas em energia.</p><p>Alteração de função de proteínas estruturais da mitocôndria e mitofagia estão</p><p>relacionadas com doenças neurológicas</p><p>O cérebro é um órgão muito ativo que consome aproximadamente 20% das nossas calorias</p><p>diárias, embora sua massa corresponda a 2% do nosso corpo. Para produzir todo o ATP</p><p>necessário para suas funções, apresenta grande quantidade de mitocôndrias, que consomem</p><p>cerca de 20% do oxigênio do nosso corpo em repouso. Por causa dessa alta demanda</p><p>energética, defeitos de função mitocondrial frequentemente ocasionam doenças</p><p>neurológicas. Alterações na OPA1, proteína que promove a fusão e o modelamento da</p><p>membrana interna mitocondrial, estão associadas à atrofia óptica hereditária, que promove</p><p>perda gradual da visão, em geral em adultos jovens. Disfunções das mitofusinas, proteínas</p><p>que promovem a fusão da membrana externa mitocondrial, estão associadas à doença de</p><p>Charcot-Marie-Tooth. Nessa patologia, há perda de função do sistema nervoso periférico, com</p><p>diminuições da função motora e da sensação de tato. A perda de função de PINK1 ou Parkina,</p><p>proteínas responsáveis pela mitofagia, associa-se às formas familiares da doença de</p><p>Parkinson, afetando neurônios dopaminérgicos e resultando em rigidez e tremor das</p><p>extremidades.</p><p>O fato de todos os organismos vivos na Terra utilizarem o ATP como “moeda” energética indica que todos</p><p>descendem de um organismo único, que já utilizava essa molécula. O ATP é uma molécula centralizadora do</p><p>metabolismo, unindo processos catabólicos, em que a quebra de moléculas grandes está relacionada com a</p><p>síntese de ATP, a anabólicos, em que a síntese de moléculas grandes associa-se à quebra de ATP (Figura 5.10). O</p><p>ATP também é a fonte de energia para o trabalho celular, incluindo movimentação física de moléculas (como a</p><p>que promove contração molecular) e transporte de moléculas através de membranas, contra gradientes. Em</p><p>células eucarióticas, a maioria da produção de ATP ocorre nas mitocôndrias.</p><p>Catabolismo completo de carboidratos</p><p>Carboidratos constituem uma fonte importante de energia. Além do armazenamento de glicogênio,</p><p>principalmente em músculos e fígado, carboidratos são ingeridos em forma de açúcares e amido. Uma dieta</p><p>equilibrada para pessoas saudáveis deve conter aproximadamente 50% de carboidratos complexos (na forma de</p><p>amido) como fonte de calorias. O glicogênio e o amido são degradados, respectivamente, no fígado e no sistema</p><p>digestório em moléculas individuais de glicose, que podem ser usadas como fonte de energia para diferentes</p><p>células.</p><p>A glicose absorvida pelas células é degradada pela via glicolítica (Figura 5.11), em um processo em que uma</p><p>sequência de enzimas do citoplasma promove transformações da molécula de glicose, até produzir duas</p><p>moléculas de piruvato. Durante esse processo, há um saldo de formação de duas moléculas de ATP mediante</p><p>reações associadas à quebra da glicose. Também ocorre a produção de duas moléculas de dinucleotídio de</p><p>nicotinamida e adenina (NADH), forma reduzida do NAD+, um cofator enzimático que age como receptor e</p><p>doador de elétrons.</p><p>Na ausência de mitocôndrias (p. ex., como ocorre nos eritrócitos) ou na ausência de oxigênio (como ocorre</p><p>nos músculos em exercício intenso), o metabolismo da glicose não progride além do piruvato, que é convertido</p><p>em lactato e secretado para o exterior da célula. O saldo final do metabolismo não mitocondrial de glicose é,</p><p>portanto, a produção de duas moléculas de ATP.</p><p>Na atividade mitocondrial, as duas moléculas de piruvato formadas a partir da glicose são transportadas por</p><p>meio do VDAC na membrana externa mitocondrial e de um transportador para piruvato na membrana interna da</p><p>mitocôndria, chegando à matriz da organela. Na matriz, cada piruvato sofre a ação da piruvato desidrogenase,</p><p>enzima que converte piruvato em acetilcoenzima A (acetil-CoA) (ver Figura 5.11), produzindo também uma</p><p>molécula de CO2 e reduzindo um NAD+ a NADH. A acetil-CoA é transformada pelo ciclo do ácido cítrico</p><p>(também conhecido como ciclo dos ácidos tricarboxílicos, ou ciclo de Krebs), no qual ocorre uma série de</p><p>reações que resultam na produção de um ATP, redução de mais 3 moléculas de NAD+, além da redução de um</p><p>FAD para FADH2 e liberação de duas moléculas de CO2.</p><p>Figura 5.10 O papel central de trifosfato de adenosina (ATP) no metabolismo celular. ATP é o</p><p>intermediário molecular que liga as reações catabólicas, de degradação de moléculas que são</p><p>ingeridas ou armazenadas, às anabólicas, que sintetizam moléculas complexas. A quebra de ATP em</p><p>ADP + Pi (fosfato inorgânico) é também fonte de energia para o trabalho celular, como a</p><p>movimentação mecânica de moléculas ou transporte de íons e metabólitos.</p><p>Figura 5.11 A mitocôndria promove a degradação completa de glicose em dióxido de carbono (CO2).</p><p>Reações metabólicas da via glicolítica no citoplasma convertem uma molécula de glicose em duas de</p><p>piruvato, gerando um saldo de duas moléculas de trifosfato de adenosina (ATP) e duas moléculas de</p><p>dinucleotídio de nicotinamida e adenina (NADH). Na ausência de mitocôndrias ou oxigênio, o piruvato</p><p>pode ser convertido a lactato, com reoxidação de NADH. Na presença de atividade mitocondrial, o</p><p>piruvato é transportado para a matriz da organela, onde cada piruvato produz acetilcoenzima A</p><p>(acetil-CoA), CO2 e NADH, e, posteriormente, cada acetil-CoA gera 3 NADH, 1 FADH2, 2 CO2 e 1 ATP</p><p>no ciclo do ácido cítrico.</p><p>Com isso, completa-se a degradação completa de uma molécula de glicose em CO2. No total, foram</p><p>produzidas duas moléculas de ATP durante a glicólise fora da mitocôndria e mais duas moléculas de ATP no</p><p>ciclo do ácido cítrico (uma para cada molécula de acetil-CoA) na matriz mitocondrial. Além disso, foram</p><p>produzidos 2 NADH na glicólise, 2 NADH na conversão de dois piruvatos a duas acetil-CoA, e 6 NADH no</p><p>ciclo do ácido cítrico, totalizando 10 NADH. Foram também produzidos 2 FADH2. Os NADH e FADH2</p><p>produzidos constituirão mais moléculas de ATP durante o processo de fosforilação oxidativa.</p><p>Fosforilação oxidativa</p><p>A fosforilação oxidativa é o processo em que é produzida a maior parte do ATP de nossas células, diferindo da</p><p>síntese de ATP durante a glicólise e o ciclo do ácido cítrico, pois não está relacionado com uma única enzima,</p><p>que acopla a modificação de um substrato à produção de uma molécula de ATP. Na fosforilação oxidativa, a</p><p>oxidação de moléculas reduzidas, NADH e FADH2, associa-se à produção de ATP por meio de um gradiente</p><p>transmembrana de prótons, e envolve múltiplas proteínas (Figura 5.12).</p><p>Figura 5.12 Fosforilação oxidativa mitocondrial. Na cadeia de transporte de elétrons, aqueles que</p><p>provêm de dinucleotídio de nicotinamida e adenina (NADH) e FADH2 são transportados para O2,</p><p>reduzindo-o a duas moléculas de água. Esse processo relaciona-se com o transporte de prótons da</p><p>matriz mitocondrial para o espaço intermembranas. O retorno desses prótons pela ATP-sintase</p><p>associa-se à produção de trifosfato de adenosina (ATP) a partir de difosfato de adenosina (ADP) e</p><p>fosfato inorgânico (Pi).</p><p>O processo ocorre da seguinte maneira: NAD e FAD reduzidos (i. e., NADH e FADH2) doam seus elétrons</p><p>para os complexos proteicos da cadeia de transporte de elétrons situada na membrana mitocondrial interna. Essa</p><p>cadeia compreende proteínas da membrana mitocondrial interna e moléculas que doam e recebem elétrons. Estes</p><p>são organizados de modo que passam sequencialmente por componentes com menor afinidade por elétrons para</p><p>os com maior afinidade por elétrons. O O2 é o destino final dessa cadeia, sendo o componente com maior</p><p>afinidade por esses elétrons. Resumidamente, quatro elétrons provenientes de NADHs e/ou FADH2s combinam-</p><p>se com uma molécula de O2, formando duas moléculas de água.</p><p>Essas reações de ganho e perda de elétrons, denominadas “reações de oxirredução”, reoxidam NADH e</p><p>FADH2, reduzem O2 e são reações favoráveis termodinamicamente. A energia química constituída por essas</p><p>reações é em grande parte conservada e usada para transportar prótons (H+) da matriz mitocondrial para o espaço</p><p>intermembranas (ver Figura 5.12). O acúmulo de prótons forma o gradiente transmembrana de prótons. Isso</p><p>ocorre porque as reações de oxirredução da cadeia de transporte de elétrons alteram a estrutura das proteínas de</p><p>membrana, levando ao transporte de prótons da matriz mitocondrial para o espaço intermembranas (ver Figura</p><p>5.12). Os prótons não retornam à matriz espontaneamente, pois a membrana interna mitocondrial é pouco</p><p>permeável a prótons. Isso resulta em acúmulo de prótons no espaço intermembranas.</p><p>O caminho preferencial para o retorno dos prótons acumulados no espaço intermembranas para a matriz</p><p>mitocondrial é a ATP-sintase, uma proteína que viabiliza a entrada do próton por um canal transmembrana. O</p><p>retorno dos prótons por meio da ATP-sintase produz energia que é utilizada na síntese de ATP. A ATP-sintase é</p><p>uma enzima extremamente interessante, pois não só produz quantidades enormes de ATP, mas também apresenta</p><p>movimento giratório – a passagem de prótons faz a enzima girar dentro da membrana, e essa</p><p>movimentação</p><p>promove mudanças de conformação da enzima que levam à produção de ATP.</p><p>A produção de ATP pela fosforilação oxidativa é um processo constante nas nossas células, assim como a</p><p>degradação de ATP em ADP e Pi, associada a processos anabólicos e trabalho celular. Estima-se que, nesse ciclo</p><p>de síntese e degradação, a produção total de ATP diária de uma pessoa seja equivalente ao seu próprio peso. Essa</p><p>produção também é muito eficiente, sendo a perda de calor nas transformações metabólicas muito menor que a</p><p>perda de energia de máquinas e motores produzidos pelo homem.</p><p>É comum encontrar em livros que a quebra total da glicose produz 36 a 38 ATPs. Quatro deles são</p><p>produzidos na glicólise e no ciclo do ácido cítrico, e o restante é gerado por fosforilação oxidativa. Atualmente</p><p>tem-se conhecimento de que esse número é superestimado, e o valor real provavelmente é mais próximo de 30.</p><p>Esse saldo é variável de maneira dependente da atividade de vários transportadores mitocondriais, que também</p><p>usam a energia do gradiente transmembrana de prótons.</p><p>Proteínas ou pequenas moléculas que promovem a diminuição do gradiente</p><p>transmembrana de prótons promovem emagrecimento e aquecimento corporal</p><p>Na década de 1930 nos EUA, difundiu-se o uso de uma molécula anteriormente usada na</p><p>indústria química como tratamento para a obesidade: o 2,4-dinitrofenol. Na época, não havia</p><p>regulamentação para a distribuição e o uso de novos remédios, e a evidente eficácia do</p><p>composto em promover perda de peso promoveu a rápida difusão de seu uso. Porém, logo se</p><p>perceberam as complicações associadas a sua administração, incluindo mortes causadas por</p><p>hipertermia (aumento excessivo da temperatura corporal). A Food and Drug Administration</p><p>(FDA) americana foi então remodelada para controlar o uso e a distribuição de</p><p>medicamentos, e a disseminação e o uso humano do 2,4-dinitrofenol foram proibidos.</p><p>O 2,4-dinitrofenol promove perda de peso porque é uma molécula capaz de se ligar</p><p>reversivelmente a prótons e atravessar membranas biológicas. Desse modo, leva prótons do</p><p>espaço intermembranas para a matriz mitocondrial, sem que esses prótons passem pela ATP-</p><p>sintase. A perda da energia contida no gradiente transmembrana de prótons, sem síntese</p><p>associada de ATP, gera calor. Como são produzidos menos moléculas de ATP, há maior</p><p>degradação de moléculas de estoque de energia, como as gorduras, e perda de peso.</p><p>Infelizmente, porém, a perda de peso e a produção de calor com 2,4-dinitrofenol são pouco</p><p>controláveis, e a molécula não é, portanto, um bom fármaco para tratar a obesidade.</p><p>O 2,4-dinitrofenol não existe naturalmente, mas animais, incluindo humanos, têm</p><p>pequenas quantidades de uma proteína – proteína desacopladora –, que age de maneira</p><p>semelhante, dissipando a energia do gradiente transmembrana de prótons na forma de calor.</p><p>Atualmente se sabe que pessoas naturalmente magras, sem tendência à obesidade, têm</p><p>maior atividade dessa proteína, aproveitando menos as calorias dos alimentos, e perdendo-os</p><p>como calor.</p><p>Oxidação de ácidos graxos</p><p>Ácidos graxos são componentes dos lipídios e uma importante fonte de energia. De fato, gorduras, de modo</p><p>geral, apresentam o dobro de calorias por grama de alimento quando comparadas a carboidratos e proteínas.</p><p>Ácidos graxos têm cadeias carbônicas com a maioria das ligações simples, com alta quantidade de elétrons, por</p><p>isso produzem altas quantidades de NADH e FADH2, que, na fosforilação oxidativa, geram quantidades</p><p>significativas de ATP. A oxidação e a degradação de ácidos graxos é outro processo metabólico que ocorre na</p><p>mitocôndria, em contraste com a síntese de ácidos graxos, que é citosólica.</p><p>Ácidos graxos ativados entram na mitocôndria na forma de acil-coenzima A (“acil” é um nome genérico para</p><p>cadeias com número variado de carbonos ligados a uma coenzima A). O processo de transporte é mediado por</p><p>carnitina (uma molécula que nosso corpo sintetiza a partir de aminoácidos) e transportadores chamados</p><p>“carnitina-aciltransferases” (Figura 5.13). Na matriz mitocondrial, esses ácidos graxos são quebrados em</p><p>moléculas de acetil-CoA, com dois carbonos, pelas enzimas da via de β-oxidação de ácidos graxos. O processo</p><p>de β-oxidação reduz (i. e., transfere elétrons) para as moléculas de NAD+ e FAD, que passam a NADH e FADH2.</p><p>Essas coenzimas reduzidas são então reoxidadas (perdem elétrons) pela cadeia de transporte de elétrons, como</p><p>informado anteriormente.</p><p>Degradação de aminoácidos</p><p>Além de participar da oxidação de carboidratos e lipídios, as mitocôndrias também participam da degradação de</p><p>aminoácidos, produtos da decomposição de proteínas. Algumas enzimas transaminases, que convertem os</p><p>aminoácidos em α-cetoácidos (como os intermediários do ciclo do ácido cítrico), localizam-se nas mitocôndrias.</p><p>Além disso, no fígado, o nitrogênio dos aminoácidos é usado para formar ureia, que é então eliminada na urina.</p><p>Parte do ciclo da ureia, via que sintetiza essa molécula, ocorre na matriz mitocondrial. Dessa maneira, a</p><p>mitocôndria participa da metabolização de todos os grandes grupos de macronutrientes (carboidratos, lipídios e</p><p>proteínas), dentro de seu papel de organela central do metabolismo.</p><p>Transporte de íons cálcio</p><p>Várias vias metabólicas são reguladas pela concentração de íons cálcio, que são importantes moduladores</p><p>enzimáticos, além de ser um mensageiro secundário em vias de sinalização celular (ver Capítulo 6). Desse modo,</p><p>a presença de íons cálcio na matriz mitocondrial é importante para modular atividades metabólicas. A</p><p>mitocôndria apresenta canais (uniporters) para cálcio na sua membrana interna e pode acumular esse íon.</p><p>Também tem vias de remoção de cálcio da matriz, trocando-o por íons sódio (Na+) ou prótons (H+).</p><p>A entrada de cálcio na mitocôndria também é facilitada por sua proximidade física com o retículo</p><p>endoplasmático dentro da célula, organela que acumula e libera cálcio de modo regulado por vários estímulos</p><p>celulares. Dessa maneira, a mitocôndria também é regulada por cálcio e participa da regulação de seus níveis</p><p>dentro da célula.</p><p>Figura 5.13 Oxidação de ácidos graxos na mitocôndria. Ácidos graxos ligados à coenzima A (acil-</p><p>CoA) entram na mitocôndria de forma catalisada pela carnitina-aciltransferase. Na matriz mitocondrial,</p><p>sofrem β-oxidação, processo em que dois carbonos são removidos, gerando acetil-CoA, FADH2 e</p><p>dinucleotídio de nicotinamida e adenina (NADH), em quantidade proporcional ao tamanho da cadeia</p><p>carbônica do ácido graxo. A acetil-CoA formada é degradada no ciclo do ácido cítrico, produzindo</p><p>mais NADH e FADH2. NADH e FADH2 são reoxidados na cadeia de transporte de elétrons, gerando</p><p>um gradiente transmembrana de prótons e ATP.</p><p>Controle da apoptose</p><p>A apoptose é a morte celular regulada que será estudada em detalhes no Capítulo 9. Interessantemente, o espaço</p><p>intermembranas mitocondrial contém várias proteínas que modulam a morte celular, incluindo o citocromo C e o</p><p>AIF (do inglês apoptosis inducing factor). Para ativar a apoptose, essas proteínas precisam sair do espaço</p><p>intermembranas e estar no citoplasma, onde iniciam o processo apoptótico. Isso envolve alterar a permeabilidade</p><p>da membrana externa, por mecanismos que serão abordados adiante.</p><p>Produção de radicais livres e outras espécies oxidantes</p><p>Por realizarem uma grande quantidade de reações de oxirredução, em que ocorrem transferências de elétrons</p><p>entre moléculas, as mitocôndrias têm também a capacidade de produzir radicais livres, ou seja, moléculas que</p><p>apresentam elétrons sem par (desemparelhados). As mitocôndrias são, frequentemente, a maior fonte celular de</p><p>radicais livres e outras moléculas reativas derivadas desses radicais livres. Isso acontece porque uma pequena</p><p>parte do oxigênio que é reduzido nessas organelas, em vez de receber quatro elétrons e ser reduzido para água,</p><p>recebe um elétron, e produz um radical livre chamado “radical superóxido”, ou O2</p><p>–• (o ponto nessa abreviação</p><p>indica o elétron desemparelhado, que caracteriza os radicais livres).</p><p>O radical superóxido produzido nas mitocôndrias é rapidamente</p><p>convertido a peróxido de hidrogênio (H2O2),</p><p>uma molécula reativa, mas que não possui elétrons desemparelhados e, portanto, não é um radical livre. Essa</p><p>conversão para produzir H2O2 é catalisada pela enzima superóxido dismutase, presente tanto na matriz quanto no</p><p>espaço intermembranas mitocondrial. O H2O2 formado pode se difundir pela célula (pois atravessa membranas),</p><p>pode ser removido por peroxidases celulares (enzimas que degradam peróxidos) ou pode produzir outras espécies</p><p>reativas.</p><p>Radicais livres podem causar danos a vários tipos de moléculas em situações patológicas, mas, no caso da</p><p>produção mitocondrial constante, há mecanismos eficazes de eliminação dessas espécies que não causam</p><p>disfunção em condições normais. Radicais livres e espécies reativas derivadas das mitocôndrias podem ser</p><p>importantes mediadores de sinais intracelulares, participando da regulação da biogênese mitocondrial e da</p><p>produção de defesas antioxidantes, dentre vários outros processos fisiológicos.</p><p>Bibliografia</p><p>Alberts B, Bray D, Lewis J et al. Molecular Biology of the Cell. 3rd ed. New York: Garland Press; 1994.</p><p>Nicholls DG, Fergusson SJ. Bioenergetics 4. Academic Press; 2013.</p><p>Scheffler IE. Mitochondria. 2nd ed. Wiley; 2008.</p><p>Tzagoloff A. Mitochondria. New York: Plenum Press; 1982.</p><p>Introdução</p><p>Importância da comunicação entre as células</p><p>Componentes básicos e etapas da comunicação celular</p><p>As formas de comunicação celular podem variar dependendo da maneira como a molécula</p><p>sinalizadora é apresentada ao seu receptor específico</p><p>As moléculas sinalizadoras apresentam diversas características específicas e mecanismos de ação</p><p>Características celulares e moleculares dos receptores de superfície</p><p>Receptores acoplados à proteína G</p><p>Receptores associados a enzimas</p><p>Receptores associados a canais iônicos</p><p>O desligamento da via de sinalização é tão importante quanto sua ativação</p><p>Bibliografia</p><p>Introdução</p><p>Comunicação celular é a capacidade que toda célula apresenta de processar as informações provenientes do seu</p><p>meio ambiente ou de outras células e desenvolver uma atividade ou comportamento específico em resposta a</p><p>esses estímulos. Toda informação que chega até a célula produz uma sequência específica de eventos</p><p>intracelulares que induz uma resposta àquele dado inicial. Essa cascata de eventos intracelulares também é</p><p>conhecida como sinalização celular. Por meio da comunicação e da sinalização celular, as células interagem com</p><p>o meio ambiente e as outras células, modulando suas funções.</p><p>Tanto os organismos unicelulares (como leveduras e bactérias) quanto os multicelulares utilizam diferentes</p><p>modos de comunicação celular para desempenharem funções importantes para a célula, como sobrevivência,</p><p>diferenciação, divisão celular, migração, morte celular, controle de metabolismo, secreção, fagocitose, produção</p><p>de anticorpos, dentre outras. A comunicação celular é tão importante que a falta dessa interação é um sinal para</p><p>as células saudáveis ativarem o mecanismo interno de morte celular programada (apoptose), abordada no</p><p>Capítulo 16.</p><p>A troca de informação entre as células pode ocorrer por meio de moléculas que se conectam com proteínas</p><p>receptoras ou que atravessam canais existentes entre duas células (Figura 6.1). A forma mais comum de</p><p>comunicação ocorre por meio de moléculas que se ligam aos receptores, também chamadas “moléculas</p><p>sinalizadoras ou ligantes”, produzidas por células que enviarão a mensagem para outras células. Essas moléculas</p><p>sinalizadoras poderão ser secretadas para o meio extracelular, agindo nas células-alvo próximas ou distantes, ou</p><p>ainda, ser mantidas na superfície celular da célula sinalizadora, influenciando apenas as células adjacentes. Além</p><p>dos processos que envolvem ligantes e receptores, algumas células comunicam-se diretamente por meio de</p><p>moléculas que atravessam canais existentes entre células contíguas. Esses canais são constituídos por moléculas</p><p>proteicas das membranas de duas células, em regiões intituladas junções comunicantes ou gap junctions,</p><p>estudadas no Capítulo 8.</p><p>Neste capítulo, serão discutidas principalmente as comunicações celulares que utilizam moléculas</p><p>sinalizadoras e receptores, bem como os componentes básicos e as principais formas dessa comunicação</p><p>(parácrina, autócrina, endócrina e dependente de contato). Em seguida, serão abordadas as diferentes categorias</p><p>de moléculas sinalizadoras e as principais classes de receptores (aqueles associados à proteína G, a enzimas e os</p><p>receptores que são canais iônicos).</p><p>Importância da comunicação entre as células</p><p>As células de organismos multicelulares funcionam de maneira coordenada para manter a forma e a função dos</p><p>seus diferentes tecidos, órgãos e sistemas. A troca de informações entre essas células é essencial para que as</p><p>estruturas mencionadas se desenvolvam e mantenham a homeostase na vida adulta. Essa comunicação</p><p>intercelular já ocorria em nossos ancestrais unicelulares e era essencial para adaptação desses ao seu</p><p>microambiente. Alguns deles, como os coanoflagelados, transitam entre um modo de vida unicelular e um outro</p><p>no qual as células se dividem, porém se mantêm unidas em colônias (organismos denominados “multicelulares</p><p>facultativos”). Ao se organizarem como multicelulares, esses indivíduos passam a expressar genes essenciais na</p><p>comunicação entre as células, sugerindo que esta é a origem dos multicelulares verdadeiros. Essa interação de</p><p>unicelulares pode ter sido o primeiro passo a caminho da evolução da multicelularidade.</p><p>Figura 6.1 As células podem se comunicar de diferentes modos. A. Diversificados tipos de moléculas</p><p>sinalizadoras (ou ligantes) interagem com um receptor específico localizado na célula-alvo. Observe</p><p>que as três células representadas no desenho têm receptores diferentes que interagem com ligantes</p><p>específicos (secretados ou de contato), por isso, podem apresentar respostas celulares distintas. B.</p><p>As células também podem trocar informações mediante transporte de moléculas pequenas e íons que</p><p>atravessam canais formados entre as células.</p><p>A comunicação entre as células ocorre nos dois sentidos, ou seja, as células que emitem sinais (células</p><p>sinalizadoras) produzem os ligantes para as células que receberão os sinais (células-alvo), mas podem ser</p><p>também alvo de sinais e vice-versa (Figura 6.2). Em resposta a um ou mais sinais, as células alteram seus</p><p>processos – por exemplo, mudança de morfologia, proliferação, migração, diferenciação, morte, secreção, entre</p><p>tantos outros. É importante salientar que a resposta da célula depende da integração de dois componentes: (1) dos</p><p>sinais extracelulares recebidos em um momento específico, pois em um organismo multicelular uma célula</p><p>individual pode receber múltiplos sinais simultaneamente; e (2) do repertório de moléculas presentes na célula-</p><p>alvo, incluindo os receptores e as moléculas sinalizadoras intracelulares. Essa complexa rede de comunicação</p><p>torna possível que as funções celulares mencionadas anteriormente estejam sob o controle do organismo como</p><p>um todo, e não só da célula como um indivíduo independente.</p><p>Figura 6.2 As células que enviam os sinais para outras células denominam-se sinalizadoras e as que</p><p>recebem são as células-alvo. Como essas estruturas podem enviar e receber sinais, elas podem estar</p><p>nas duas categorias ao mesmo tempo. Os sinais recebidos pelas células podem estimular diferentes</p><p>respostas celulares, como sobrevivência, diferenciação, divisão celular, migração, morte celular,</p><p>controle de metabolismo, secreção, fagocitose etc.</p><p>Figura 6.3 Componentes integrantes de uma via de sinalização iniciada por um ligante (molécula</p><p>sinalizadora).</p><p>Componentes básicos e etapas da comunicação celular</p><p>A comunicação celular que se inicia por meio de uma molécula sinalizadora apresenta alguns componentes</p><p>fundamentais para que essa interação aconteça, como a presença de um ligante (um hormônio, um feromônio ou</p><p>um neurotransmissor, por exemplo), produzido por uma célula sinalizadora e que encontrará uma célula-alvo. O</p><p>ligante interage com um receptor específico localizado</p><p>na célula-alvo, que pode estar na superfície da célula (na</p><p>membrana plasmática) ou em seu interior (citoplasma ou núcleo).</p><p>A ativação dos receptores pelos ligantes aciona outras moléculas no interior das células – as moléculas</p><p>sinalizadoras intracelulares (que em sua maioria são proteínas) (Figura 6.3). Essas proteínas intracelulares são</p><p>ativadas ou inativadas em sequência por processos que podem envolver fosforilação e desfosforilação, por</p><p>exemplo. A fosforilação de proteínas será abordada mais adiante neste capítulo.</p><p>Em geral, toda informação que chega até a célula constitui uma sequência específica de eventos que acaba</p><p>produzindo um resultado final, que é a resposta da célula àquele estímulo inicial. Essa cascata de eventos</p><p>também é conhecida como sinalização celular, pois cada passo desse processo é um agente sinalizador para o</p><p>início da próxima etapa. A comunicação celular, ou sinalização celular, produzida por um sinal extracelular</p><p>envolve sete passos: (1) síntese da molécula sinalizadora; (2) liberação ou externalização da molécula</p><p>sinalizadora; (3) transporte da molécula sinalizadora até a célula-alvo; (4) detecção do sinal por um receptor</p><p>específico na célula-alvo; (5) ativação de uma cascata de sinalização intracelular; (6) resposta celular ao sinal</p><p>recebido, podendo ser proliferação, alteração do metabolismo celular, síntese proteica, secreção, migração,</p><p>diferenciação etc.; e (7) remoção do sinal e desligamento da sinalização, o que, geralmente, implica</p><p>encerramento da resposta celular (Figura 6.4).</p><p>A resposta da célula a um sinal depende da ligação da molécula ligante com um receptor proteico especifico,</p><p>que pode estar alocado na superfície da célula-alvo, no citoplasma ou no seu núcleo. A molécula sinalizadora</p><p>encaixa-se em um sítio deste receptor e essa interação é específica, isto é, o ligante liga-se somente ao seu</p><p>receptor e vice-versa (apesar de existirem ligantes que se conectam a mais de um receptor). Essa conexão do</p><p>ligante com seu receptor induz, geralmente, uma alteração conformacional no receptor, denominada “ativação do</p><p>receptor”, que iniciará uma sequência de reações em cascata e resultará em uma resposta celular.</p><p>Figura 6.4 Esquema das etapas da sinalização celular: (1) a célula sinalizadora é responsável pela</p><p>síntese da molécula sinal (ou ligante); (2) essa molécula deve ser exposta ao meio extracelular, sendo</p><p>liberada completamente ou permanecendo ancorada à membrana plasmática; (3) se a molécula for</p><p>liberada ao meio extracelular, esta deve se deslocar até a célula-alvo, que pode estar próxima da</p><p>célula sinalizadora (sinalização parácrina ou autócrina), ou a longas distâncias (sinalização</p><p>endócrina). Se a molécula não for liberada, as células sinalizadora e alvo devem se aproximar para</p><p>que o receptor faça contato direto com o ligante não secretado; (4) a comunicação celular inicia-se</p><p>com a detecção do sinal por um receptor específico na célula-alvo; (5) a interação do ligante com o</p><p>receptor inicia uma cascata de sinalização intracelular por ativação de diferentes proteínas em</p><p>sequência (proteínas efetoras); (6) essas proteínas efetoras estimularão diferentes respostas</p><p>celulares, como proliferação ou secreção de fatores, por exemplo.</p><p>Desse modo, a primeira molécula a sofrer essa alteração (o receptor) interage com uma segunda molécula,</p><p>que se comunica com a molécula seguinte e assim por diante. Essa ativação em sequência atua de modo</p><p>semelhante a um dispositivo elétrico que passa o sinal recebido ao dispositivo seguinte, amplificando esse sinal.</p><p>No fim dessa via de sinalização (também denominada “cascata de sinalização”), esse sinal alcançará moléculas</p><p>encarregadas de executar a resposta celular final, por isso nomeadas “moléculas (ou proteínas) efetoras”. Como</p><p>exemplo de moléculas efetoras, há os fatores de transcrição (que alterarão a expressão gênica), as proteínas do</p><p>citoesqueleto (que mudarão a arquitetura e o padrão de adesão e migração celular), ou ainda, diferentes enzimas</p><p>que podem mudar o metabolismo celular.</p><p>Fosforilação e ativação da cascata de sinalização</p><p>Após a ativação do receptor pelo ligante, as proteínas sinalizadoras intracelulares e as efetoras são ativadas e/ou</p><p>inativadas como se fossem “interruptores” que ligam ou desligam a sinalização iniciada. Esses interruptores são</p><p>acionados por processos de fosforilação–desfosforilação, que consistem na adição de um grupo fosfato a uma</p><p>molécula e sua remoção, respectivamente (Figura 6.5). A fosforilação de proteínas controla a atividade, a</p><p>estrutura e a localização de enzimas e proteínas intracelulares variadas, sendo fundamental na regulação da</p><p>cascata de sinalização.</p><p>A adição de um grupo fosfato à cadeia lateral de uma proteína pode causar a alteração conformacional da</p><p>proteína, promovendo sua ligação com outras moléculas intracelulares, e também pode tornar essa proteína</p><p>reconhecível para outras proteínas, estimulando a interação e ativação.</p><p>Na maioria das vezes, a fosforilação ocorre em resíduos de serina, treonina ou tirosina das proteínas, sendo,</p><p>portanto, uma alteração pós-traducional, por ocorrer após a tradução (síntese) proteica. Nas vias de sinalização</p><p>intracelulares, a fosforilação pode ocorrer em receptores, proteínas sinalizadoras intracelulares e até em proteínas</p><p>efetoras. Sabe-se, no entanto, que essa alteração acontece em todos os processos celulares, incluindo vias</p><p>metabólicas, ciclo celular, replicação, transcrição gênica, entre outros. A adição de fosfato a um aminoácido é</p><p>catalisada por enzimas genericamente denominadas “quinases” (ou “cinases”). Sua remoção é catalisada pelas</p><p>fosfatases. Muitas quinases e fosfatases atuam em diferentes substratos (i. e., podem fosforilar e desfosforilar</p><p>diferentes proteínas), porém, elas também apresentam certa especificidade. Por exemplo, há quinases que</p><p>fosforilam somente resíduos de serina e treoninas, outras que fosforilam só resíduos de tirosina. Isso não</p><p>significa que essas enzimas fosforilam qualquer serina/treonina ou tirosina. Os resíduos a serem fosforilados são</p><p>reconhecidos por essas enzimas em um contexto – os resíduos adjacentes e a conformação espacial são essenciais</p><p>para que a enzima reconheça e fosforile (ou desfosforile) o resíduo de um substrato específico. É importante</p><p>ressaltar que a fosforilação não resulta obrigatoriamente em ativação de uma proteína, pois há fosforilações que</p><p>desligam proteínas, embora não seja frequente. Da mesma maneira, a desfosforilação nem sempre resulta em</p><p>desativação.</p><p>Proteínas G</p><p>Outro tipo de interruptor é representado pelas proteínas que se ligam a nucleotídios de guaninas: as proteínas G.</p><p>Há duas classes dessas: as monoméricas, também denominadas “GTPases pequenas”, e as triméricas, compostas</p><p>pelas subunidades α, β e γ. As triméricas estão sempre associadas aos receptores acoplados à proteína G (do</p><p>inglês G protein-coupled receptors [GPCR]). As proteínas G mudam a sua conformação quando estão associadas</p><p>a guanosina-trifosfato (GTP) ou guanosina-difosfato (GDP). Nas vias de sinalização, essas proteínas tornam-se</p><p>ativas quando ligadas a GTP e inativas quando associadas a GDP (Figura 6.6). Quando ativas, as proteínas G</p><p>interagem com as proteínas da cascata de sinalização, do mesmo modo que ocorre quando uma proteína é</p><p>fosforilada (ou desfosforilada); portanto, proteínas G ativas transmitem essa ativação para proteínas sinalizadoras</p><p>intracelulares e efetores, conduzindo, assim, o sinal vindo do meio extracelular. Como o nome sugere, todas as</p><p>proteínas G são capazes de hidrolisar GTP em GDP (ou seja, GTP perde um fosfato e se torna GDP). Com</p><p>frequência, a conversão de proteína-GTP para proteína-GDP, e vice-versa, é finamente controlado por uma outra</p><p>classe de proteínas. Aquelas que aumentam a capacidade das GTPases de hidrolisar GTP (terminando assim sua</p><p>ativação) são denominadas “proteínas ativadoras de GTPases” ou, em inglês, GTPase activating proteins</p><p>(GAPs); as que promovem a troca de GDP por GTP (ativando as GTPases) são os fatores trocadores de GTP ou,</p><p>em inglês, GTP exchange factors (GEFs).</p><p>É importante ressaltar que nesse caso não ocorre uma reação de</p><p>fosforilação de GDP, mas, sim, a troca do nucleotídio como um todo.</p><p>Figura 6.5 A transferência de um grupo fosfato de trifosfato de adenosina (ATP) para a cadeia lateral</p><p>de um aminoácido da proteína-alvo “A” inativa é promovida por uma proteína quinase. A proteína “A”</p><p>se torna ativada e interage com outras proteínas intracelulares (proteína “B” inativa), ativando-a. A</p><p>proteína “B” ativada ativará a proteína “C” inativa e assim sucessivamente. Essa ativação em cadeia</p><p>induz a cascata de sinalização intracelular. A remoção do grupo fosfato é catalisada por uma</p><p>fosfatase, inativando a proteína.</p><p>Figura 6.6 A proteína G e as GTPases monoméricas podem se ligar a guanosina-trifosfato (GTP) ou</p><p>a guanosina-difosfato (GDP). Nas vias de sinalização, essas proteínas ativam-se quando ligadas a</p><p>GTP e inativam-se quando acopladas a GDP.</p><p>Uma vez conhecidos os componentes e as atividades necessários para a realização da comunicação celular, o</p><p>próximo passo é estudar a interação desses mecanismos. Para entender as diferentes respostas das células frente</p><p>aos estímulos, a comunicação celular deve ser estudada sob duas perspectivas que ocorrem simultaneamente: (1)</p><p>o modo como o ligante é oferecido à célula-alvo; e (2) a atividade do receptor assim que ele se torna ativado pelo</p><p>ligante.</p><p>Sobre a forma como o ligante é oferecido ao receptor, as vias podem ser classificadas como parácrinas,</p><p>autócrinas, endócrinas ou dependentes de contato. Sobre a atividade do receptor após sua ativação, as vias de</p><p>sinalização podem ser classificadas como receptores acoplados a proteínas G, receptores associados a enzimas e</p><p>receptores associados a canais iônicos. Essas duas classificações serão abordadas a seguir.</p><p>As formas de comunicação celular podem variar dependendo da</p><p>maneira como a molécula sinalizadora é apresentada ao seu receptor</p><p>específico</p><p>Didaticamente, distinguem-se quatro categorias de comunicação celular com base na forma em que o ligante é</p><p>apresentado ao seu receptor específico: (1) parácrina, que ocorre pela secreção de moléculas que atuam nas</p><p>células-alvo vizinhas, próximas ao local onde os ligantes foram secretados. Nessa comunicação, os ligantes</p><p>percorrem distâncias curtas até encontrarem os receptores específicos. Os neurônios utilizam um tipo específico</p><p>de comunicação parácrina, secretando mediadores químicos (neurotransmissores) em um espaço muito pequeno</p><p>entre a célula sinalizadora e a célula-alvo (de apenas alguns nanômetros), denominado “fenda sináptica”; (2)</p><p>autócrina, que acontece do mesmo modo que a comunicação parácrina, porém, neste caso, os ligantes produzidos</p><p>agem nas próprias células que produzem e liberam esses ligantes. As células tumorais utilizam-se esse</p><p>mecanismo para manter sua própria sobrevivência; (3) endócrina, pela qual ocorre a secreção de moléculas</p><p>sinalizadoras denominadas “hormônios”, que são, geralmente, secretados pelas glândulas endócrinas. Os</p><p>hormônios são lançados no espaço extracelular, penetram nos capilares sanguíneos e distribuem-se por todo o</p><p>corpo, atuando em células-alvo distantes. Um exemplo desse tipo de comunicação celular vem da hipófise, uma</p><p>glândula que secreta o hormônio tireotrófico como molécula sinalizadora, que percorre longa distância até</p><p>encontrar as células-alvo na tireoide; e (4) dependente de contato, que acontece quando a molécula sinalizadora</p><p>permanece ligada à superfície da célula que a sintetiza, ou seja, o ligante não se torna livre no meio extracelular.</p><p>Nesse caso, a célula-alvo precisa fazer contato direto com a célula sinalizadora para que o ligante e o receptor se</p><p>conectem e a comunicação aconteça. Essa via de comunicação é muito utilizada durante o desenvolvimento</p><p>embrionário (Figura 6.7).</p><p>Comunicação parácrina</p><p>Células que estão próximas umas das outras podem liberar moléculas sinalizadoras que viajarão distâncias muito</p><p>curtas até encontrarem seus receptores específicos nas células-alvo vizinhas (ver Figura 6.7 A). Esse tipo de</p><p>sinalização, em que a comunicação celular acontece localmente, é denominada “sinalização parácrina”.</p><p>A sinalização parácrina torna possível que as células próximas coordenem atividades específicas em</p><p>conjunto. Um exemplo da importância dessa sinalização acontece durante o desenvolvimento embrionário,</p><p>quando um grupo de células migram ou se diferenciam em conjunto, definindo a identidade dessas células.</p><p>Cortes histológicos da medula espinal durante seu desenvolvimento evidenciam a proteína sinalizadora Shh e seu</p><p>receptor em um grupo específico de células que, mais tarde, se diferenciaram em neurônios motores da medula.</p><p>Experimentos mostraram que, quando as proteínas sinalizadoras Shh são impedidas de ligarem aos receptores</p><p>específicos, o grupo de células adquire uma identidade celular diferente.</p><p>Figura 6.7 Os desenhos esquemáticos mostram os quatro tipos principais de comunicação entre as</p><p>células por meio de moléculas específicas (sinais químicos). A. Comunicação parácrina, em que</p><p>moléculas secretadas atravessam apenas alguns milímetros, no máximo, alguns centímetros, até</p><p>atingirem as células com receptores para a molécula sinalizadora. Os neurônios podem se comunicar</p><p>por neurotransmissores de forma parácrina. Nesse tipo de comunicação, a molécula</p><p>neurotransmissora é liberada a uma distância de apenas 20 nm da célula que recebe a informação.</p><p>Os receptores da célula-alvo localizam-se exclusivamente na área da membrana em frente ao</p><p>terminal do axônio, que é a parte final, dilatada, desse prolongamento neuronal. B. Comunicação</p><p>autócrina, em que a molécula sinalizadora age na própria célula que a emitiu, sendo a célula-alvo do</p><p>seu próprio ligante. C. Comunicação endócrina, que se caracteriza pela secreção de uma molécula</p><p>sinalizadora que é transportada pelo sangue (p. ex., hormônio) e atua, a distância, em células-alvo</p><p>que contêm receptores com afinidade para o ligante. D. Comunicação dependente de contato, que se</p><p>caracteriza pelo contato íntimo entre as células sinalizadoras e alvo, pois não requer liberação da</p><p>molécula sinalizadora para o meio extracelular.</p><p>Existem células especializadas na secreção parácrina, ou seja, na produção de mediadores químicos de ação</p><p>local, como a histamina e a heparina, por exemplo. Essas moléculas sinalizadoras são sintetizadas por células do</p><p>tecido conjuntivo denominadas “mastócitos”, que apresentam o citoplasma repleto de grânulos contendo</p><p>histamina e heparina. Mediante estímulo imunitário, ação de agentes químicos, lesão tecidual e outros estímulos,</p><p>os grânulos são expulsos dos mastócitos, liberando histamina e heparina para o meio extracelular.</p><p>Muitas outras células podem produzir variados ligantes de ação local na inflamação, na proliferação celular,</p><p>na contração da musculatura lisa de vasos sanguíneos, sistema digestório e brônquios, e na secreção celular.</p><p>Como exemplo, serão mencionadas as prostaglandinas, moléculas sinalizadoras produzidas praticamente por</p><p>todas as células do organismo humano. Existem pelo menos 10 famílias de prostaglandinas, denominadas PGA,</p><p>PGB, PGC, PGD, PGE, PGF, PGG, PGH, PGI e PGJ. Cada uma dessas famílias apresenta vários subtipos. As</p><p>prostaglandinas têm efeitos extremamente variados e, por esse motivo, são de grande interesse clínico e</p><p>biológico. Estudos mostraram que as prostaglandinas foram encontradas em grande quantidade na urina de</p><p>pacientes contaminados pelo coronavírus (covid-19), mesmo após 10 a 12 dias da alta hospitalar, indicando seu</p><p>envolvimento na resposta imunológica desencadeada pela infecção pelo coronavírus 2 da síndrome respiratória</p><p>aguda grave (SARS-CoV-2). Todas as prostaglandinas são derivadas de um ácido graxo com 20 átomos de</p><p>carbono, o ácido araquidônico. Esse ácido graxo se forma a partir dos fosfolipídios da membrana plasmática,</p><p>pela ação de fosfolipases que são ativadas por estímulos específicos e inespecíficos, variando de uma célula para</p><p>outra (Figura 6.8).</p><p>Seria impossível mencionar todos os efeitos das prostaglandinas. Elas parecem regular a flexibilidade</p><p>dos</p><p>eritrócitos, que se deformam para atravessar os capilares sanguíneos mais finos. Algumas prostaglandinas</p><p>diminuem a secreção de ácido clorídrico pelas glândulas da mucosa do estômago e inibem a formação de úlceras</p><p>pépticas (úlceras do estômago). Outras participam da regulação do sistema reprodutor feminino, influenciando</p><p>no ciclo menstrual. Prostaglandinas também estimulam a contração do músculo liso do útero, podendo induzir o</p><p>aborto quando injetadas no saco amniótico do embrião durante o primeiro trimestre da gestação. Injeções</p><p>intravenosas no 9o mês de gestação induzem o parto.</p><p>Além das prostaglandinas, o ácido araquidônico da membrana plasmática dá origem a outros mediadores de</p><p>ação local. Todos os mediadores derivados do ácido araquidônico são conhecidos pelo nome genérico de</p><p>eicosanoides e incluem as prostaglandinas, os tromboxanos e os leucotrienos (Figura 6.8). Todos esses</p><p>compostos participam do processo inflamatório. Os anti-inflamatórios de natureza esteroide, como a cortisona,</p><p>inibem a liberação do ácido araquidônico a partir dos fosfolipídios da membrana, bloqueando, assim, a produção</p><p>de todos os mediadores locais mencionados: prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos. Anti-inflamatórios</p><p>não esteroides (AINEs), como o ácido acetilsalicílico (AAS) e a indometacina, bloqueiam a formação de</p><p>prostaglandinas e tromboxanos, mas não impedem a de leucotrienos.</p><p>Figura 6.8 Desenho ilustrativo da síntese e secreção de eicosanoides. A partir de um estímulo (p. ex.,</p><p>a inflamação), os fosfolipídios de membrana podem ser clivados por fosfolipases (como a fosfolipase</p><p>A2), produzindo o ácido araquidônico, um ácido graxo essencial. Duas enzimas metabolizarão o ácido</p><p>araquidônico, constituindo subprotutos diferentes; a ciclo-oxigenase (COX) catalisará a formação dos</p><p>precursores das prostaglandinas e dos tromboxanos, e a lipo-oxigenase (5-LOX) produzirá os</p><p>precursores dos leucotrienos. Os eicosanoides serão liberados para o meio extracelular e se</p><p>acoplarão a receptores de superfície das células-alvo, como os receptores acoplados a proteínas G.</p><p>Outro exemplo muito importante de comunicação parácrina é a sinalização sináptica, realizada entre células</p><p>nervosas e seus alvos. Quando o neurônio pré-sináptico recebe um estímulo para liberar os ligantes na fenda</p><p>sináptica, denominados neurotransmissores, estes se difundem rapidamente para o meio extracelular. Como o</p><p>espaço nessa fenda é muito pequeno, os neurotransmissores encontram rapidamente seus receptores alvos,</p><p>ligando-se de maneira específica e desencadeando uma cascata de reações nas células-alvo (p. ex., abertura de</p><p>canais iônicos ou mudança de potencial de membrana).</p><p>Comunicação autócrina</p><p>A sinalização autócrina é muito semelhante à parácrina, porém, na primeira, as células-alvo são as mesmas</p><p>células que sintetizaram e secretaram o ligante para o meio extracelular (ver Figura 6.7 B), ou seja, as células</p><p>liberam os ligantes que farão ligação com os próprios receptores. Muitas moléculas sinalizadoras denominadas</p><p>fatores de crescimento atuam por esse tipo de comunicação. Fatores de crescimento são moléculas secretadas e</p><p>biologicamente ativas que afetam a sobrevivência, o crescimento e a proliferação celular. Na sinalização</p><p>autócrina, esses fatores estimulam o crescimento e proliferação das próprias células que os sintetizaram. Esse</p><p>mecanismo é muito comum em células tumorais, em que muitas vezes esses fatores de crescimento são</p><p>produzidos e liberados descontroladamente, estimulando o crescimento e a proliferação inapropriada dessas</p><p>células e das células vizinhas não tumorais. Esse processo promove a formação das massas tumorais.</p><p>Comunicação endócrina</p><p>Processo relativamente lento, porque os hormônios (ligantes) demoram para se distribuírem pelo corpo,</p><p>carregados pela corrente sanguínea (ver Figura 6.7 C). Depois de deixarem os capilares por difusão, os</p><p>hormônios são captados pelas células-alvo que contêm receptores específicos para essas moléculas. A</p><p>especificidade dos hormônios depende não somente de sua natureza química, mas também da existência de</p><p>receptores apropriados nas células-alvo. Cada tipo de célula endócrina geralmente secreta um hormônio, e as</p><p>células que contêm receptores para esse hormônio reagirão de uma maneira correspondente à natureza da célula-</p><p>alvo. Por exemplo, a resposta celular pode variar entre a ativação ou a inibição da atividade secretória, conforme</p><p>o hormônio e o tipo de célula-alvo. Como os hormônios se diluem muito, tanto no sangue quanto no fluido</p><p>extracelular, é indispensável que os receptores os fixem com grande afinidade.</p><p>Embora a maioria dos hormônios seja hidrossolúvel e atue em receptores situados na membrana plasmática,</p><p>alguns são lipossolúveis, ou seja, atravessam a membrana celular com facilidade e se fixam aos receptores</p><p>localizados dentro do citoplasma ou no núcleo das células-alvo. São exemplos os hormônios esteroides e os da</p><p>glândula tireoide – tiroxina ou tetraiodotironina (T4) e tri-iodotironina (T3). Os hormônios esteroides e os da</p><p>tireoide são transportados no plasma sanguíneo ligados a proteínas transportadoras, mas, no momento de</p><p>atravessar a membrana plasmática, essas proteínas são separadas dos hormônios e somente estes atravessam a</p><p>membrana celular da célula-alvo, encontrando seus respectivos receptores dentro das células.</p><p>São exemplos de hormônios esteroides os sexuais masculino (testosterona) e feminino (estrógenos e</p><p>progesterona), e os corticosteroides, produzidos pela camada cortical da glândula suprarrenal.</p><p>Outra diferença entre os hormônios hidrossolúveis e os lipossolúveis diz respeito ao tempo de sua</p><p>permanência no sangue e nos fluidos teciduais. Geralmente, os hidrossolúveis são eliminados do sangue poucos</p><p>minutos após serem secretados.</p><p>Comunicação dependente de contato</p><p>O quarto tipo de comunicação celular (envolvendo um ligante e um receptor) exige um contato íntimo entre duas</p><p>células (ver Figura 6.7 D). Nesse tipo de interação, não há necessidade de liberação da molécula sintetizada. O</p><p>ligante é exposto na membrana plasmática das células sinalizadoras e faz contato direto com a proteína receptora</p><p>exposta na membrana plasmática da célula-alvo. Esse tipo de sinalização é muito importante durante o</p><p>desenvolvimento embrionário, um exemplo dessa comunicação acontece na via de Notch (Figura 6.9).</p><p>Nessa via, notch é o nome da proteína receptora localizada na superfície da célula-alvo e interage com os</p><p>ligantes que ficam ancorados na célula sinalizadora, como a proteína delta ou serrata (também conhecida como</p><p>“Jagged” em humanos). A ligação do receptor notch com o ligante delta, por exemplo, estimula a clivagem do</p><p>domínio intracelular da proteína receptora notch (NICD), em que a porção clivada irá se translocar até o núcleo</p><p>para regular complexos de transcrição.</p><p>Muitas moléculas sinalizadoras podem interagir com seus receptores por duas ou três formas de comunicação</p><p>diferentes. Por exemplo, alguns ligantes derivados de aminoácidos, como a epinefrina, atuam como</p><p>neurotransmissores mediante a sinalização parácrina, assim como também agem como hormônios pela</p><p>sinalização endócrina. Alguns fatores de crescimento, como o fator de crescimento epidermal (do inglês</p><p>epidermal growth factor [EGF]), ancoram na membrana plasmática das células sinalizadoras e apresentam uma</p><p>porção exposta ao meio extracelular que pode se ligar a um receptor de membrana da célula-alvo por contato</p><p>direto (comunicação dependente de contato). Em contrapartida, essa mesma molécula de EGF pode ser clivada</p><p>por proteases contidas na célula sinalizadora, liberando a molécula para o meio extracelular e podendo agir em</p><p>células-alvo distantes por meio da comunicação endócrina.</p><p>As moléculas sinalizadoras apresentam diversas características</p><p>específicas e mecanismos de ação</p><p>As moléculas sinalizadoras podem ter diferentes origens, composições e propriedades físico-químicas. Esses</p><p>ligantes podem ser proteínas, pequenos peptídios (neurotransmissores), derivados de aminoácidos, moléculas</p><p>hidrofóbicas (estrógeno, prolactina,</p><p>para o desenvolvimento da vida</p><p>eucariótica, com células muito maiores e mais complexas, que requerem mais energia. De fato, embora alguns</p><p>eucariotos atuais não tenham mitocôndrias, essa ocorrência é rara, e estudos evolutivos sugerem que esses</p><p>organismos perderam mitocôndrias durante sua evolução e não que se desenvolveram como eucariotos na</p><p>ausência de mitocôndrias.</p><p>Células eucariontes compartimentalizadas</p><p>A célula eucarionte é como uma fábrica organizada em diferentes setores (Figura 1.6). Além de aumentar a</p><p>eficiência de cada etapa, a separação das atividades em diferentes compartimentos possibilita que as células</p><p>eucariontes atinjam maior tamanho e maior complexidade, sem prejuízo de suas funções.</p><p>Citoplasma</p><p>As organelas estão distribuídas no citoplasma da célula eucariótica (ver Figura 1.6). O citoplasma é um meio</p><p>aquoso no qual estão as organelas e, em algumas células, depósitos de substâncias. Um intenso tráfego de</p><p>proteínas acontece entre o citoplasma e as organelas que depende da interação com as membranas.</p><p>Além de organelas como mitocôndrias, retículo endoplasmático, complexo de Golgi, lisossomos e</p><p>peroxissomos, em alguns tipos celulares o citoplasma pode apresentar depósitos de diferentes substâncias, como</p><p>grânulos de glicogênio nas células musculares. São frequentes o acúmulo do polissacarídio glicogênio, sob a</p><p>forma de grânulos esféricos com 30 ηm de diâmetro, que podem existir isoladamente ou agrupados (Figura 1.7).</p><p>O glicogênio, um polímero da glicose, é uma reserva energética para as células animais. Muitas células contêm</p><p>gotículas lipídicas de constituição química e tamanho muito variáveis (Figura 1.8). Depósitos de pigmentos</p><p>também não são raros; um exemplo é a melanina, encontrada nos cromatóforos e nas células da epiderme</p><p>(camada mais superficial da pele), e outro exemplo é a lipofuscina, pigmento pardo que se acumula em algumas</p><p>células de vida longa, como neurônios e células musculares cardíacas, à medida que elas envelhecem. Os</p><p>depósitos que contêm pigmento são, em parte, responsáveis pela cor dos seres vivos, com implicações nos</p><p>processos de mimetismo, na atração para acasalamento e na proteção contra as radiações ultravioleta da luz do</p><p>sol.</p><p>Figura 1.6 Corte lateral de uma célula eucarionte animal. O núcleo é separado do citoplasma pelo</p><p>envelope nuclear, formado por duas bicamadas lipídicas, com poros. Observe o retículo</p><p>endoplasmático próximo ao núcleo e na sequência, o complexo de Golgi. Muitos poros nucleares</p><p>estão contidos no envelope nuclear; além disso, observam-se lisossomos e vesículas no citoplasma.</p><p>Figura 1.7 À direita, micrografia eletrônica mostrando grânulos de glicogênio em célula do fígado; a</p><p>maioria deles forma aglomerados (setas). (Aumento: 62.000×.) Os grânulos de glicogênio são cadeias</p><p>ramificadas formadas por monômeros de glicose, como mostrado em destaque à esquerda.</p><p>Preenchendo o espaço entre as organelas e os depósitos, ou inclusões, encontra-se o citoplama. É formado</p><p>por água, íons variados, aminoácidos, precursores dos ácidos nucleicos, numerosas enzimas, incluindo as que</p><p>realizam a glicólise anaeróbia e as que participam da degradação e da síntese de carboidratos, de ácidos graxos,</p><p>de aminoácidos e de outras moléculas importantes para as células. O citoplasma é organizado pelo citoesqueleto,</p><p>constituído pelos microtúbulos, filamentos de actina e filamentos intermediários. Os microtúbulos e os</p><p>microfilamentos de actina, com a cooperação das proteínas motoras, participam dos movimentos celulares e dos</p><p>deslocamentos de partículas dentro das células. Além disso, os microfilamentos de actina e os microtúbulos,</p><p>estes constituídos por tubulina, são compostos por unidades monoméricas que podem se despolimerizar e</p><p>polimerizar novamente, de modo reversível e dinâmico. Quando despolimerizadas (separadas umas das outras),</p><p>os monômeros de actina e tubulina conferem maior fluidez ao citoplasma. Quando polimerizadas em</p><p>microfibrilas e microtúbulos, conferem a consistência de gel à região citoplasmática em que se encontram. Desse</p><p>modo, o citoesqueleto não somente organiza o interior das células, mas também estabelece, modifica e mantém a</p><p>forma delas. É responsável pelos movimentos celulares como contração, formação de pseudópodos e</p><p>deslocamentos intracelulares de organelas, cromossomos, vesículas e variados grânulos.</p><p>A membrana plasmática separa o citoplasma do meio extracelular e contribui para manter constante o meio</p><p>intracelular, que é diferente do extracelular. Apresenta cerca de 7 a 10 μm de espessura e é mostrada nas</p><p>eletromicrografias como duas linhas escuras separadas por um espaço central claro. A membrana plasmática é</p><p>uma bicamada lipídica formada principalmente por fosfolipídios e que contêm uma quantidade variável de</p><p>proteínas e de lipídios. As variações de proteínas e lipídios conferem à membrana plasmática uma complexidade</p><p>estrutural e funcional condizente com sua posição de revestimento celular e está descrita em mais detalhes no</p><p>Capítulo 4.</p><p>Núcleo</p><p>Uma das principais características da célula eucarionte é a presença de um núcleo de formato variável, porém</p><p>bem individualizado e separado do restante da célula por duas membranas. Esta membrana dupla, que é parte do</p><p>envelope nuclear, além de isolar os componentes nucleares, medeia o transporte entre o núcleo e o citoplasma.</p><p>Os poros nucleares, inseridos no envelope nuclear, regulam o intenso tráfego de macromoléculas do núcleo para</p><p>o citoplasma e vice-versa (ver Capítulo 9). Todas as moléculas de RNA do citoplasma são sintetizadas no núcleo,</p><p>e todas as proteínas do núcleo são sintetizadas pelos ribossomos, fora do núcleo. O transporte mediado pelos</p><p>poros nucleares depende, na maioria dos casos, de gasto energético e de sinais específicos de localização nuclear,</p><p>reconhecidos por proteínas que auxiliam a importação e a exportação nuclear (importinas e exportinas,</p><p>respectivamente [ver Capítulo 13]).</p><p>Figura 1.8 Eletromicrografia mostrando depósitos temporários de lipídios no citoplasma de célula</p><p>absortiva do intestino delgado (setas). Essas células apresentam muitos prolongamentos em sua</p><p>superfície livre, os microvilos ou microvilosidades, que aumentam a superfície e facilitam a absorção</p><p>de nutrientes. À esquerda, um esquema representando a célula absortiva e os depósitos de lipídios</p><p>(LD; em amarelo). À direita, note mitocôndrias (M) e lisossomos (L). Depois de absorvidos pelas</p><p>células, os lipídios acumulam-se temporariamente nas cisternas do retículo endoplasmático liso,</p><p>estando envolvidos por membranas desse retículo (setas). (Aumento: 10.000×.) (Cortesia de H. I.</p><p>Friedman.)</p><p>A membrana externa do envelope nuclear é contínua com a do retículo endoplasmático (ver Figura 1.6). O</p><p>surgimento do núcleo em eucariotos possibilitou isolar e concentrar o material genético da célula em um</p><p>compartimento protegido contra a ação de nucleases que possam estar presentes no citoplasma, mantendo a sua</p><p>integridade. É também a partir do núcleo que os processos de divisão celular têm início, com a duplicação das</p><p>células, mas com a manutenção do mesmo material genético ao longo das gerações. Além disso, o núcleo</p><p>possibilitou que eucariotos desenvolvessem um sistema mais sofisticado de processamento das moléculas de</p><p>RNA, transcritas a partir do DNA, antes que elas fossem utilizadas no núcleo (como alguns pequenos RNAs não</p><p>codificadores) ou no citoplasma, para a síntese de proteínas (como os rRNAs, tRNAs, mRNAs). Dessa maneira,</p><p>os processos envolvendo a expressão gênica dos organismos propiciaram o desenvolvimento de organismos mais</p><p>complexos ao longo da evolução. O material genético é armazenado no núcleo na forma de cromatina, que é</p><p>constituída por DNA associado a proteínas, principalmente histonas. A cromatina pode apresentar-se como</p><p>eucromatina ou heterocromatina, caracterizada por regiões mais compactadas. A heterocromatina geralmente</p><p>encontra-se distribuída entre as regiões de eucromatina (Figura 1.9), mas frequentemente pode ser observada</p><p>associada à membrana interna do envelope nuclear. O núcleo também</p><p>ácido retinoico) e até mesmo gases (óxido nítrico). Independentemente de</p><p>sua composição, a maioria das moléculas exercem suas funções quando entram em contato com seu receptor</p><p>específico na célula-alvo. Os ligantes podem ser divididos em quatro categorias gerais: (1) pequenas moléculas</p><p>lipofílicas que se difundem pela membrana plasmática e interagem com receptores intracelulares; (2) moléculas</p><p>lipofílicas grandes que não conseguem atravessar a membrana plasmática e se ligam a receptores de superfície;</p><p>(3) moléculas hidrofílicas que não atravessam a membrana plasmática e agem por ligação aos receptores de</p><p>membrana; e (4) gases que se difundem pela membrana plasmática e ativam diretamente as enzimas</p><p>intracelulares, discutidos a seguir.</p><p>Pequenas moléculas sinalizadoras lipofílicas se difundem pela</p><p>membrana plasmática e interagem com receptores intracelulares</p><p>Alguns ligantes podem se difundir pela membrana plasmática, pois são pequenas moléculas lipofílicas, como os</p><p>hormônios esteroides, por exemplo. Esses hormônios são sintetizados a partir do colesterol, e, sendo moléculas</p><p>pequenas, com cerca de 300 Da (dáltons), lipossolúveis, atravessam facilmente as membranas celulares por</p><p>difusão passiva. Esses hormônios (p. ex., estrógenos, testosterona, progesterona e corticosteroides) são</p><p>transportados pelo plasma sanguíneo, sob a forma de complexos com proteínas anfipáticas, isto é, que</p><p>apresentam moléculas com regiões hidrofóbicas, que se ligam aos hormônios esteroides, e regiões hidrofílicas,</p><p>responsáveis pela solubilidade do complexo no plasma sanguíneo e no líquido que banha as células. Antes de sua</p><p>penetração nas células, esses hormônios separam-se da proteína transportadora, que permanece no líquido</p><p>extracelular.</p><p>Figura 6.9 Via de sinalização de Notch (canônica). A interação do ligante de notch (delta) sintetizado</p><p>pela célula sinalizadora, com seu receptor específico (notch), localizado na célula-alvo, resulta na</p><p>clivagem do receptor por enzimas desintegrinas/metaloproteinases denominadas “ADAM” (do inglês a</p><p>disintegrin and metaloproteinase). A quebra desse receptor origina dois fragmentos: um extracelular</p><p>(do inglês notch extracellular domain [NECD]), e um fragmento intracelular (do inglês notch</p><p>intracellular domain [NICD]). O fragmento intracelular NICD transloca-se para o núcleo e interage com</p><p>proteínas do complexo de transcrição, iniciando a síntese de genes.</p><p>Uma vez penetrando nas células-alvo, os hormônios esteroides ligam-se a receptores intracelulares</p><p>específicos, situados no citoplasma ou no núcleo, e causam modificações na conformação espacial desses</p><p>receptores, ativando-os (Figura 6.10). A ativação do receptor aumenta sua afinidade pelo ácido</p><p>desoxirribonucleico (DNA) e a possibilidade de união do receptor proteico ativado com determinados segmentos</p><p>de genes nucleares específicos, regulando a transcrição desses genes. Os hormônios da tireoide são aminoácidos</p><p>hidrofóbicos modificados, mas atuam de modo semelhante aos hormônios esteroides.</p><p>Os hormônios esteroides persistem no plasma sanguíneo durante horas, e os hormônios da tireoide por tempo</p><p>ainda mais longo, muitas vezes durante alguns dias. Isso significa que os hormônios lipossolúveis tendem a</p><p>mediar respostas mais prolongadas.</p><p>Moléculas hidrofílicas e moléculas lipofílicas grandes interagem com</p><p>receptores de superfície celular</p><p>A maioria das moléculas sinalizadoras são muito grandes para atravessarem a membrana plasmática ou são</p><p>hidrofílicas. Por isso, esses ligantes precisam se conectar com proteínas receptoras de superfície nas células-alvo</p><p>para iniciarem a sinalização celular.</p><p>As moléculas hidrossolúveis podem ser classificadas em dois grandes grupos: (1) hormônios peptídicos,</p><p>como insulina, fatores de crescimento e glucagon; e (2) pequenas moléculas com carga, como epinefrina e</p><p>histamina, que são derivadas de aminoácidos e atuam como hormônios e neurotransmissores. Todos os</p><p>hormônios hidrossolúveis são captados por receptores localizados na membrana plasmática das células-alvo</p><p>(Figura 6.11). Alguns, como os receptores para insulina, são denominados “catalíticos”, porque, quando ativados,</p><p>funcionam como enzimas, geralmente quinases proteicas (enzimas que atuam em proteínas) que fosforilam a</p><p>hidroxila da tirosina de proteínas citoplasmáticas específicas.</p><p>Figura 6.10 O desenho esquemático mostra o modelo proposto para a configuração espacial do</p><p>receptor intracelular para hormônio esteroide e as modificações sofridas pelo receptor ao se combinar</p><p>com o respectivo hormônio. A. Receptor não combinado com o esteroide, porque o segmento de sua</p><p>molécula que tem afinidade pelo ácido desoxirribonucleico (DNA) está coberto por uma proteína</p><p>inibidora, que o inativa. B. O hormônio esteroide modifica a forma do complexo receptor, libera a</p><p>molécula da proteína inibidora e expõe a região do receptor que tem afinidade para o DNA; assim, o</p><p>complexo do esteroide com seu receptor combina-se com determinadas sequências nucleotídicas do</p><p>DNA nuclear e regula a atividade gênica. Geralmente há um aumento na síntese de ácido</p><p>ribonucleico mensageiro (mRNA).</p><p>Contudo, a maioria das moléculas sinalizadoras hidrossolúveis age em receptores que atuam por intermédio</p><p>de uma cadeia de moléculas, que modifica os níveis intracelulares de adenosina 3,5-monofosfato cíclico (cAMP)</p><p>ou Ca2+. cAMP e Ca2+ são denominados “mediadores” ou “mensageiros intracelulares”. Mais detalhes sobre</p><p>esses dois tipos de sinalização celular serão abordados posteriormente neste capítulo.</p><p>As moléculas lipossolúveis grandes, como os eicosanoides e os leucotrienos, são ligantes que contém lipídios</p><p>em sua composição. Como dito anteriormente, as prostaglandinas fazem parte do grupo dos eicosanoides e são</p><p>sintetizadas a partir de um precursor comum, o ácido araquidônico, que é derivado de fosfolipídios e</p><p>diacilglicerol (DAG). Muitas prostaglandinas agem localmente nas comunicações celulares parácrinas e</p><p>autócrinas, sendo rapidamente degradadas após sua liberação. Algumas prostaglandinas induzem agregação</p><p>plaquetária e estimulam a adesão das plaquetas à parede dos vasos sanguíneos, modulando a cicatrização. Outras</p><p>prostaglandinas acumulam-se no útero gravídico durante o parto e desempenham papel importante durante a</p><p>contração uterina.</p><p>Figura 6.11 O desenho esquemático mostra como moléculas hidrofílicas afetam as funções celulares</p><p>agindo em receptores (glicoproteínas) da membrana plasmática. As moléculas mensageiras (ligantes)</p><p>hidrofílicas geralmente são de natureza proteica. Os fatores (ligantes) de natureza lipídica, como os</p><p>hormônios esteroides, agem em receptores intracelulares. Cerca de 80% dos sinais químicos, aos</p><p>quais as células estão sujeitas normalmente, são hidrofílicos. Observe, na parte inferior do desenho, a</p><p>variedade de respostas que dependem das características da célula-alvo.</p><p>Moléculas sinalizadoras gasosas difundem-se pela membrana</p><p>plasmática e ativam diretamente as enzimas intracelulares</p><p>Um exemplo de molécula sinalizadora gasosa é o óxido nítrico (ON). Este é uma molécula gasosa simples e pode</p><p>ser sintetizada a partir da L-arginina por ação de uma enzima chamada “óxido nítrico-sintase” (do inglês nitric</p><p>oxide synthase [NOS]) que apresenta três isoformas diferentes: a NOS1 (cNOS ou nNOS), a NOS2 (ou iNOS) e</p><p>a NOS3 (ou eNOS) (Figura 6.12). Diferentes mecanismos estimulam a produção de ON pela célula. Por</p><p>exemplo, as células endoteliais (que revestem internamente os vasos sanguíneos) têm receptores específicos</p><p>(receptores colinérgicos) que captam o neurotransmissor acetilcolina (ACh) liberado pelas terminações dos</p><p>nervos do sistema autônomo parassimpático. Os receptores colinérgicos ativados fazem conexão,</p><p>intracelularmente, com uma proteína G que estimula a formação de trifosfato de inositol (IP3), desencadeando</p><p>uma cadeia de sinais que promove a liberação de íons Ca2+ do seu reservatório no retículo endoplasmático liso</p><p>(REL) para o citoplasma da célula endotelial. O íon Ca2+ é um substrato para a enzima NOS e possibilita a</p><p>síntese do ON a partir da quebra da</p><p>apresenta algumas estruturas subnucleares</p><p>não envoltas por membranas, como os nucléolos. Estes comportam as regiões do DNA ribossomal, responsáveis</p><p>pela transcrição do rRNA (ver Capítulo 9). As principais funções do núcleo de eucariotos são armazenar a</p><p>informação genética (i. e., o DNA), regular a transcrição (síntese de diferentes RNAs a partir do DNA) e</p><p>controlar o crescimento e a divisão celular (ver capítulo 9).</p><p>Retículo endoplasmático</p><p>O retículo endoplasmático participa da síntese de proteínas e das modificações em lipídios. Organizado como</p><p>um sistema contínuo no citoplasma das células eucariontes, o retículo é formado por uma rede de vesículas</p><p>achatadas, esféricas e túbulos que se intercomunicam. Embora apareçam separados nos cortes examinados ao</p><p>microscópio eletrônico, a membrana externa do envelope nuclear é contínua com a membrana dessa rede de</p><p>vesículas e túbulos (Figura 1.10). Distinguem-se o retículo endoplasmático rugoso (RER), ou granular, que é</p><p>contínuo ao retículo endoplasmático liso (REL) (ver Figuras 1.9 e 1.10). A membrana do RER apresenta</p><p>ribossomos na sua superfície voltada para o citoplasma. Proteínas traduzidas nos ribossomos associados ao RER</p><p>iniciam seu dobramento no interior dessa organela (ver Capítulo 13). Além dos mecanismos celulares que</p><p>garantem a estrutura tridimensional correta das proteínas, nessa organela as proteínas passam por algumas</p><p>modificações pós-traducionais específicas, como a formação de pontes dissulfeto e a glicosilação. A partir do</p><p>retículo endoplasmático, as proteínas são direcionadas ao complexo de Golgi, do qual partem vesículas que são</p><p>carreadas para a membrana plasmática, para os endossomos ou lisossomos (ver Capítulo 15).</p><p>O REL apresenta-se principalmente como túbulos que se anastomosam e se estendem com o retículo rugoso.</p><p>O REL é muito desenvolvido em determinados tipos de células como, por exemplo, nas que secretam hormônios</p><p>esteroides, nas células hepáticas e nas células da glândula suprarrenal. Esse compartimento tem grande</p><p>participação na desintoxicação de fármacos e na metabolização e modificação de lipídios.</p><p>Figura 1.9 Eletromicrografia de célula do tecido conjuntivo (macrófago). Em alguns pontos, a</p><p>superfície celular apresenta prolongamentos irregulares. Na imagem à esquerda, o núcleo foi</p><p>marcado em azul, o complexo de Golgi ficou contornado em laranja e o retículo endoplasmático liso</p><p>(REL) ficou contornado em vermelho. Na imagem à direita, é possível visualizar todas essas</p><p>estruturas, e também os lisossomos (L) e o centríolo. (Aumento: 15.000×.)</p><p>Figura 1.10 Eletromicrografias de célula do intestino (parte superior) e de parte do citoplasma de uma</p><p>célula do tecido conjuntivo (parte inferior). Na figura superior, observa-se o complexo de Golgi (G) e</p><p>porção do retículo endoplasmático (RE). (Aumento: 25.000×.) Na figura inferior, observam-se os</p><p>corpos mais escuros e alongados – as mitocôndrias (contornadas em azul). Essa célula,</p><p>especializada na síntese de proteínas, apresenta abundante retículo endoplasmático rugoso ou</p><p>granular (RER, em vermelho). Observe a dupla membrana das mitocôndrias. (Aumento: 60.000×.)</p><p>Complexo de Golgi</p><p>Essa organela, também conhecida por complexo golgiense ou aparelho de Golgi, é constituída por um número</p><p>variável de vesículas circulares achatadas e por vesículas esféricas de diferentes tamanhos, que parecem brotar</p><p>das primeiras (ver Figuras 1.9 e 1.10). Em muitas células, o complexo de Golgi localiza-se em posição constante,</p><p>quase sempre próximo ao núcleo e ao retículo endoplasmático (ver Figura 1.9); em outras células, ele se encontra</p><p>mais distante. Entre as principais funções dessa organela estão a separação, a modificação (principalmente a</p><p>glicosilação) e o endereçamento das moléculas sintetizadas nas células, encaminhando-as para as vesículas de</p><p>secreção, para os lisossomos, para as vesículas que permanecerão no citoplasma ou para a membrana celular.</p><p>Lisossomos</p><p>A atividade enzimática dos lisossomos é fundamental para a digestão de moléculas internalizadas por pinocitose,</p><p>por fagocitose, ou, então, organelas da própria célula, por autofagia. A destruição e renovação de organelas é um</p><p>processo fisiológico que promove a manutenção dos componentes da célula em bom estado funcional e</p><p>quantidade adequada às suas necessidades conforme as condições do meio. As organelas desgastadas pelo uso</p><p>são eliminadas e substituídas por organelas novas em um processo cíclico, mantendo a homeostase celular. Os</p><p>lisossomos são organelas de formato e tamanho muito variáveis e medem, frequentemente, entre 0,5 e 3 μm de</p><p>diâmetro (ver Figuras 1.6 e 1.9). Seu interior apresenta um pH ácido e contém diferentes enzimas hidrolíticas. A</p><p>manutenção do pH ácido dentro do lisossomo depende da atividade de proteínas que funcionam como bombas de</p><p>prótons, alojadas na membrana dessa organela. As enzimas hidrolíticas catalisam o rompimento de ligações</p><p>covalentes moleculares e geralmente têm atividade máxima a um pH em torno de 5,5 a 6. Desta maneira, só estão</p><p>ativas dentro do lisossomo. A dependência do pH ácido garante que essas enzimas só ajam no lisossomo e</p><p>também protejam as células de eventuais danos, caso algumas saiam dessa estrutura.</p><p>Autofagia</p><p>As células eucarióticas têm um sistema de renovação de organelas e reutilização de seus</p><p>componentes, denominado “autofagia”. Esse termo foi estabelecido pelo bioquímico Christian</p><p>de Duve, em 1963. A descoberta dos mecanismos envolvidos na regulação desse sistema</p><p>levou o cientista Yoshinori Ohsumi a ganhar o prêmio Nobel em Fisiologia e Medicina em</p><p>2016. Esse mecanismo tem papel essencial na homeostase, eliminando organelas mais</p><p>velhas, e reutilizando seus componentes. Por outro lado, problemas na regulação desse</p><p>sistema podem causar algumas doenças. Pelo menos três tipos diferentes de autofagia são</p><p>reconhecidos: macroautofagia, microautofagia e autofagia mediada por chaperonas. O tipo</p><p>mais frequente é a macroautofagia, na qual organelas inteiras são encapsuladas por uma</p><p>membrana, formando um autofagossomo. Essa membrana se fundirá com a de um</p><p>lisossomo, gerando um “autolisossomo”, e seus componentes serão degradados. Na</p><p>microautofagia, pequenas porções do citoplasma são engolfadas por lisossomos e, em</p><p>seguida, degradadas nessa organela. Na autofagia mediada por chaperonas, algumas</p><p>proteínas com uma sequência peptídica específica (KFERQ-like) são reconhecidas por uma</p><p>chaperona, em seguida esse complexo é translocado para o lisossomo após interagir com</p><p>uma proteína de membrana do lisossomo.</p><p>Em geral, a autofagia pode ser induzida por diferentes estresses, como a falta de</p><p>nutrientes. A degradação de componentes celulares resulta diretamente em aminoácidos que</p><p>podem ser utilizados para outras funções nas células. No fígado, esses aminoácidos são</p><p>essenciais para a gliconeogênese. O papel constitutivo do sistema de autofagia é ainda mais</p><p>destacado quando há acúmulo de proteínas nas células, como acontece na doença de</p><p>Parkinson. Células derivadas de doenças neurodegenerativas apresentam acúmulo de</p><p>vacúolos de autofagia. A indução farmacológica da autofagia, inclusive, já mostrou redução</p><p>de agregados proteicos em células neurais, bem como reduziu a progressão dos sintomas em</p><p>modelos animais.</p><p>Endossomos</p><p>Os endossomos são compartimentos transitórios que recebem as moléculas importadas do citoplasma pelas</p><p>vesículas de endocitose, que se originam da membrana plasmática. Eles são responsáveis pela separação e pelo</p><p>endereçamento do material que penetra no citoplasma pelas vesículas de endocitose. Grande parte desse material</p><p>é encaminhado para os lisossomos; porém, muitas moléculas passam dos endossomos para o citoplasma, e outras</p><p>são devolvidas para a superfície celular. Esses compartimentos podem ser considerados como uma parte da via</p><p>lisossomal, porque muitas moléculas que se direcionam para os lisossomos passam antes pelos endossomos.</p><p>O compartimento endossomal é constituído de elementos separados; é um sistema extenso, que se inicia na</p><p>periferia do citoplasma e estende-se até as proximidades do</p><p>núcleo celular. É formado por vesículas e túbulos,</p><p>cujo interior apresenta pH progressivamente mais ácido (de 6,5 a 5), desde as primeiras vesículas até aquelas que</p><p>degradam a substância endocitada.</p><p>Mitocôndrias</p><p>A principal função das mitocôndrias é a transformação da energia proveniente dos alimentos armazenada nas</p><p>moléculas de ácidos graxos e glicose em calor e moléculas de trifosfato de adenosina (ATP). A energia</p><p>armazenada na molécula de ATP é usada pelas células para realizar suas variadas atividades, como</p><p>movimentação, secreção e divisão mitótica. As mitocôndrias participam também de outros processos do</p><p>metabolismo celular, variáveis conforme o tipo de célula (ver Capítulo 5), e podem apresentar-se sob diferentes</p><p>formatos, desde esféricas até mais alongadas (ver Figuras 1.8 e 1.10). Essas organelas são revestidas pelas</p><p>membranas externa e interna. A membrana interna é pregueada, originando dobras em formato de prateleiras ou</p><p>de túbulos, como pode ser observado nas micrografias eletrônicas (ver Figura 1.10); ela aloja complexos de</p><p>proteínas como a cadeia transportadora de elétrons e a ATP sintase, que sintetiza o ATP. A presença de duas</p><p>membranas é importante para a função desempenhada pelas mitocôndrias.</p><p>Peroxissomos</p><p>Organelas que comportam enzimas oxidativas que participam de variados processos no metabolismo celular,</p><p>dentre eles a detoxificação de espécies reativas de oxigênio e a oxidação de ácidos graxos. Por exemplo, cerca da</p><p>metade do álcool etílico (etanol) consumido por uma pessoa é destruído por oxidação nos peroxissomos das</p><p>células do fígado e dos rins. Os peroxissomos também participam da síntese de colesterol, ácidos biliares e</p><p>lipídios. Aproximadamente 90% das bainhas de mielina encontradas nos axônios são formadas por um lipídio</p><p>sintetizado somente nos peroxissomos, por isso, alterações nessas organelas muitas vezes estão diretamente</p><p>associadas a distúrbios no sistema nervoso. Essas organelas apresentam tamanho variável e, ao microscópio</p><p>eletrônico, uma matriz granular envolta por membrana.</p><p>Doenças causadas por problemas nos peroxissomos</p><p>A síndrome cérebro-hepatorrenal, ou síndrome de Zellweger, é um distúrbio hereditário raro,</p><p>caracterizado por diferentes alterações neurológicas, hepáticas e renais, que geralmente</p><p>causam a morte ainda na infância. Observou-se que o fígado e os rins desses pacientes</p><p>apresentam peroxissomos vazios, constituídos somente pelas membranas, sem as enzimas</p><p>normalmente localizadas no interior dessas organelas. Essas enzimas aparecem livres no</p><p>citoplasma e, portanto, não são capazes de funcionar normalmente. As células desses</p><p>pacientes não perdem a capacidade de sintetizar as enzimas típicas dos peroxissomos, mas,</p><p>sim, a possibilidade de transferir para os peroxissomos as enzimas produzidas. O estudo</p><p>genético dos portadores da síndrome de Zellweger detectou mutações em muitos genes,</p><p>todos codificadores de proteínas que participam do processo de importação de enzimas pelos</p><p>peroxissomos. Esses genes já foram isolados, e foi demonstrado que as proteínas que eles</p><p>codificam são receptores para enzimas dos peroxissomos ou, então, participam da introdução</p><p>das enzimas nos peroxissomos. A quantidade de genes e proteínas envolvidos mostra a</p><p>complexidade do processo de translocação de enzimas para o interior dessas organelas.</p><p>Elas têm sido estudadas nas células do rim e do fígado de mamíferos. Entre outras enzimas, contêm catalase,</p><p>enzimas da betaoxidação dos ácidos graxos, urato-oxidase e D-aminoácido-oxidase. A catalase forma cristaloides</p><p>eletrodensos nessa organela, tornando possível sua identificação ao microscópio eletrônico. O conteúdo</p><p>enzimático dos peroxissomos varia muito a cada célula, e nota-se que nem todos os peroxissomos em uma</p><p>mesma célula têm a mesma composição enzimática. Essas enzimas são produzidas pelos polirribossomos do</p><p>citoplasma e transportadas para os peroxissomos, conforme as necessidades da célula e, muitas vezes, como uma</p><p>adaptação para a destruição de moléculas estranhas que penetram nas células, como álcool etílico e diferentes</p><p>fármacos.</p><p>A catalase celular é a enzima capaz de converter peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e oxigênio:</p><p>2 H2O2 → 2 H2O + O2</p><p>A atividade da catalase é importante porque o peróxido de hidrogênio (H2O2) que se forma nos peroxissomos</p><p>é um forte oxidante e prejudicaria a célula se não fosse eliminado rapidamente.</p><p>Os peroxissomos também participam da metabolização do ácido úrico. A enzima D-aminoácido-oxidase</p><p>metaboliza D-aminoácidos da parede das bactérias que penetram no organismo, pois as proteínas dos mamíferos</p><p>são constituídas exclusivamente por L-aminoácidos. Os peroxissomos participam com as mitocôndrias da</p><p>betaoxidação dos ácidos graxos, assim intitulada porque os ácidos graxos são rompidos no carbono da posição</p><p>dois ou beta. Os peroxissomos catalisam a degradação dos ácidos graxos, produzindo acetilcoenzima A (acetil-</p><p>CoA), que pode penetrar nas mitocôndrias, nas quais participará da síntese de ATP por meio do ciclo do ácido</p><p>cítrico (ciclo de Krebs). As moléculas de acetil-CoA podem ser utilizadas em outros compartimentos</p><p>citoplasmáticos para a síntese de moléculas diversas. Calcula-se que 30% dos ácidos graxos sejam oxidados em</p><p>acetil-CoA nos peroxissomos.</p><p>Bibliografia</p><p>Alberts B, Johnson A, Lewis J et al. Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC; 2008.</p><p>De Duve C. A guided Tour of the Living Cell. WH Freeman Trade; 1984.</p><p>De Duve C. Blueprint for a Cell: An Essay on the Nature and Origin of Life. 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There must be a prokaryote somewhere: microbiology’s search for itself. Microbiol Mol Biol Rev. 1994;58(1):1-9.</p><p>Introdução</p><p>Composição celular</p><p>Molécula da água é assimétrica</p><p>Propriedades biológicas das macromoléculas estão relacionadas com sua afinidade pela água</p><p>Proteínas são polímeros de aminoácidos</p><p>A sequência de aminoácidos influi na forma e função das proteínas</p><p>Chaperonas auxiliam no enovelamento de peptídios complexos e na destruição de proteínas</p><p>defeituosas</p><p>Enzimas viabilizam o metabolismo celular</p><p>A atividade enzimática pode ser alterada</p><p>Complexos enzimáticos promovem reações sequenciais</p><p>Isoenzimas: pequenas diferenças importantes</p><p>Ácidos nucleicos são polímeros de nucleotídios</p><p>O DNA é o repositório da informação genética</p><p>e a transmite para as células-filhas</p><p>Transcrição: o DNA como molde para a síntese de RNA</p><p>RNAs não codificantes</p><p>RNAs catalíticos</p><p>Lipídios</p><p>Os polissacarídios formam reservas nutritivas e unem-se a proteínas para formar glicoproteínas</p><p>(função enzimática e estrutural) e proteoglicanas (função estrutural)</p><p>Bibliografia</p><p>Introdução</p><p>As moléculas que constituem as células são formadas pelos mesmos átomos encontrados em nosso planeta,</p><p>todavia, na origem e evolução dessas células, alguns tipos de átomos foram selecionados para a constituição das</p><p>biomoléculas. Cerca de 99% da massa das células é formada de hidrogênio, carbono, oxigênio e nitrogênio,</p><p>enquanto na crosta terrestre os quatro elementos mais abundantes são oxigênio (≈ 46%), silício (≈ 28%),</p><p>alumínio (≈ 8%) e ferro (≈ 5%). Excluindo-se a água, nas células existe predominância absoluta dos compostos</p><p>de carbono, extremamente raros na crosta terrestre (≈ 0,02%). Portanto, uma célula primordial, e as que dela</p><p>evoluíram, contém os compostos de carbono (compostos orgânicos), cujas propriedades químicas são a base da</p><p>vida como se conhece.</p><p>Composição celular</p><p>A matéria viva é constituída por biomoléculas – compostos essenciais para a estrutura e o funcionamento de um</p><p>organismo –, que frequentemente são originadas exclusivamente por processos biológicos. Dessas biomoléculas,</p><p>quatro categorias destacam-se por suas abundância e funções: proteínas, carboidratos (açúcares), ácidos</p><p>nucleicos e lipídios. Os três primeiros grupos são moléculas poliméricas e de alta massa molecular, por isso</p><p>também denominadas “macromoléculas”. Proteínas, carboidratos e ácidos nucleicos são polímeros (ou</p><p>biopolímeros) constituídos pela repetição de unidades menores, chamadas “monômeros”. Essas unidades podem</p><p>ser iguais ou diferentes; no primeiro caso, intitulam-se homopolímeros, como o glicogênio, e no segundo,</p><p>heteropolímeros, como a maioria das proteínas.</p><p>Os monômeros de proteínas, carboidratos e ácidos nucleicos são denominados “aminoácidos”,</p><p>“monossacarídios” e “nucleotídios”, respectivamente (Figura 2.1). As proteínas e os polímeros de carboidratos</p><p>são também chamados “polipeptídios” e “polissacarídios”, nessa ordem. A diversidade estrutural e funcional</p><p>desses polímeros depende da variedade de seus monômeros e de suas propriedades químicas.</p><p>O último grupo, os lipídios, abrange compostos bastante variados, cuja principal característica que os define é</p><p>a insolubilidade em água, devido à sua natureza apolar.</p><p>Figura 2.1 Quatro classes principais de biomoléculas compõem a célula: carboidratos, lipídios,</p><p>proteínas e ácidos nucleicos. O diagrama resume os componentes básicos, seus polímeros e suas</p><p>funções. (Adaptada de https://teachers.henrico.k12.va.us/henrico/smith_d/.)</p><p>Frequentemente as biomoléculas se associam para formar complexos como as lipoproteínas, glicoproteínas e</p><p>proteoglicanas (proteínas combinadas com polissacarídios) e as nucleoproteínas (ácidos nucleicos e proteínas).</p><p>As biomoléculas citadas são grandes e correspondem a compostos orgânicos (assim denominados porque</p><p>contêm átomos de carbono e hidrogênio), mas, a vida também depende de compostos orgânicos menores, como</p><p>as vitaminas, bem como de moléculas inorgânicas, como a água e os sais minerais. Juntas, essas moléculas são</p><p>responsáveis pela constituição e pelo funcionamento das células, por meio de complexas relações químicas.</p><p>Molécula da água é assimétrica</p><p>Conforme abordado no Capítulo 1, as primeiras células surgiram na massa líquida que cobria a maior parte da</p><p>superfície terrestre há bilhões de anos. A partir de moléculas orgânicas originadas antes da existência de qualquer</p><p>ser vivo (origem pré-biótica), formaram-se arranjos de lipídios (micelas) que evoluíram para formar membranas,</p><p>constituindo-se, assim, as primeiras células. A origem das células associa-se à água de tal modo que esta é, sem</p><p>exceção, a molécula mais abundante em suas composições. As moléculas de proteínas, lipídios e polissacarídios</p><p>têm abundâncias diferentes entre células, mas todas as células contêm água. Esse composto não é uma molécula</p><p>inerte, com a única função de preencher espaços; ao contrário, a água e seus íons (H+ e OH–) influenciam na</p><p>configuração e nas propriedades biológicas das biomoléculas.</p><p>A molécula de água é morfológica e eletricamente assimétrica. Devido à estrutura eletrônica da molécula, os</p><p>dois átomos de hidrogênio formam com o de oxigênio um ângulo de 104,5°, em média, portanto, apesar de ser</p><p>representada pela fórmula H–O–H, a molécula de água não é um bastão reto. A assimetria de cargas elétricas</p><p>decorre da forte atração exercida pelo núcleo do oxigênio sobre os elétrons da molécula como um todo</p><p>(eletronegatividade), logo, os elétrons da molécula de água estão distribuídos de modo não uniforme: no lado do</p><p>https://teachers.henrico.k12.va.us/henrico/smith_d/</p><p>oxigênio há uma carga líquida negativa e cada um dos dois hidrogênios apresenta uma carga líquida positiva.</p><p>Essa distribuição desigual de cargas faz da molécula de água um dipolo.</p><p>Assim, o oxigênio (relativamente negativo) ocupa o centro de um tetraedro, e os hidrogênios (relativamente</p><p>positivos) posicionam-se em dois extremos, conforme mostra a Figura 2.2. Os outros dois vértices são ocupados</p><p>pelos outros elétrons do oxigênio. O resultado é uma molécula polar.</p><p>A carga líquida negativa do oxigênio interage com a carga líquida positiva de um hidrogênio de uma</p><p>molécula de água vizinha, formando uma ligação de hidrogênio (ou ponte de hidrogênio; ver Figura 2.2). O</p><p>dipolo da água é forte o suficiente para que ela interaja com cargas elétricas ou outros dipolos (p. ex., formados</p><p>por hidrogênios ligados a outros átomos eletronegativos, como em grupos amina). Por sua natureza dipolar e as</p><p>ligações de hidrogênio entre suas moléculas, a água é um solvente com características únicas, como: capacidade</p><p>térmica, ponto de ebulição relativamente alto, tensão superficial, entre outras. Substâncias iônicas ou polares são</p><p>solúveis em água devido às possíveis interações de seu dipolo com as cargas positivas, negativas ou com outros</p><p>dipolos. Essas interações diminuem a energia do sistema, tornando-o mais estável, ou seja, a relação entre água e</p><p>íons, ou entre água e dipolos, torna o sistema mais estável do que se estivessem separados.</p><p>Os cristais de NaCl, por exemplo, dissolvem-se com facilidade em água porque, apesar da atração</p><p>eletrostática entre o Cl– e o Na+ desse sal, cada um desses íons em solução é atraído pelas moléculas de água,</p><p>sendo estabilizados pelos dipolos da água. Por esse mecanismo, o cristal se rompe, resultando nos íons</p><p>hidratados de Cl– e Na+, altamente estáveis e em uma situação de menor energia no sistema.</p><p>Propriedades biológicas das macromoléculas estão relacionadas com</p><p>sua afinidade pela água</p><p>As biomoléculas contêm em sua estrutura grupos químicos que apresentam afinidade pela água (grupos polares)</p><p>ou que não apresentam afinidade pela água (grupos apolares), repelindo-a. Os grupos polares principais são</p><p>carboxila, hidroxila, aldeído, sulfato e fosfato. Moléculas com alto teor de grupos polares são muito solúveis em</p><p>água e denominam-se hidrofílicas (hidro, água, e filos, amigo). A maioria dos carboidratos, dos ácidos nucleicos</p><p>e de muitas proteínas é hidrofílica. Em contrapartida, moléculas com poucos grupos polares ou nenhum são</p><p>insolúveis na água, sendo denominadas “hidrofóbicas” (hidro, água; fobos, aversão). Como exemplos, podem ser</p><p>citados os lipídios, a parafina e os óleos – essas moléculas são repelidas pela água.</p><p>Figura 2.2 A. Esquema representando o dipolo da água. B. A projeção da forma tridimensional de</p><p>sua molécula. C. Arranjo espacial entre moléculas de água, influenciado pelas pontes de hidrogênio.</p><p>Existem também macromoléculas, geralmente alongadas, que apresentam uma região hidrofílica e outra</p><p>hidrofóbica, sendo designadas como anfipáticas, ou anfifílicas, dotadas da capacidade de associar-se</p><p>simultaneamente a água e a compostos hidrofílicos, pela sua extremidade polar, e a compostos hidrofóbicos, pela</p><p>extremidade apolar. As</p><p>moléculas anfipáticas exercem importantes funções biológicas e estão presentes em todas</p><p>as membranas celulares.</p><p>As unidades que formam as biomoléculas podem interagir mediante dois tipos de ligações, que podem ser</p><p>agrupadas de acordo com a energia necessária para serem formadas ou desfeitas (Tabela 2.1). De um lado estão</p><p>as ligações fortes, denominadas “covalentes”, resultantes do compartilhamento de elétrons entre dois átomos,</p><p>criando uniões fortes e estáveis que consomem altas quantidades de energia para sua formação. É o tipo de união</p><p>que se observa nas ligações entre aminoácidos, entre monossacarídios e entre nucleotídios, que constituem</p><p>respectivamente, as proteínas, os carboidratos e os ácidos nucleicos. Do outro lado, estão as ligações fracas, de</p><p>natureza variada, que se formam com pequeno gasto energético e podem ser desfeitas por procedimentos suaves</p><p>como aquecimento moderado e alteração da concentração iônica do meio. As principais ligações fracas são:</p><p>pontes de hidrogênio, ligações iônicas e interações hidrofóbicas.</p><p>As pontes de hidrogênio são interações entre o dipolo formado por um átomo de hidrogênio ligado a um</p><p>átomo eletronegativo e a nuvem eletrônica de outro átomo eletronegativo. É possível exemplificar esse tipo de</p><p>ligação pelas interações entre moléculas de água, em que os hidrogênios parcialmente positivos se unem ao</p><p>átomo de oxigênio, parcialmente negativo, de outra molécula vizinha (ver Figura 2.2 C). Pontes de hidrogênio</p><p>são direcionais por natureza e suficientemente energéticas para promoverem interações orientadas inter e</p><p>intramoleculares, induzindo modificações estruturais ou criando complexos entre biomoléculas. Por exemplo, em</p><p>proteínas, estas interações podem ocorrer entre o hidrogênio de uma amina e o oxigênio de uma carbonila de</p><p>aminoácidos diferentes, sendo fundamentais para a definição de sua estrutura tridimensional. As pontes de</p><p>hidrogênio são também importantes no pareamento entre as duas cadeias complementares do ácido</p><p>desoxirribonucleico (DNA). Nesse caso, as pontes de hidrogênio ocorrem entre pares de bases.</p><p>Tabela 2.1 Energia despendida para romper algumas ligações moleculares de interesse biológico.</p><p>Tipo de ligação</p><p>Energia</p><p>(kcal/mol)</p><p>Ligações covalentes (fortes) H3C—CH3 88 (simples)</p><p>C=O 170 (dupla)</p><p>N≡N 226 (tripla)</p><p>Ligações não covalentes (fracas) Ponte de H ≈ 1 a 7</p><p>Ligação iônica ≈ 5</p><p>Interação hidrofóbica ≈ 1 a 3</p><p>As ligações iônicas formam-se quando um grupo ácido se prende a um básico; são exemplos: as ligações</p><p>entre aminoácidos básicos e ácidos (ver boxe Importância das cadeias laterais de aminoácidos); ou entre as</p><p>glicosaminoglicanas (que contêm grupos sulfato) e as proteínas básicas.</p><p>As interações hidrofóbicas ocorrem entre moléculas apolares que tendem a se agregar em ambiente aquoso,</p><p>criando partições (ou compartimentos) apolares. Consistem em um fenômeno de natureza entrópica, não sendo,</p><p>portanto, propriamente uma ligação, como ocorre nas pontes de hidrogênio ou na ligação eletrostática, sendo</p><p>mais adequadamente definida como uma interação. O exemplo mais importante de interação hidrofóbica em</p><p>biologia ocorre nas membranas da célula (ver Capítulo 4), nas quais as duas camadas de lipídios se associam</p><p>principalmente em virtude desse tipo de interação. Essa relação é necessária para a formação e a manutenção de</p><p>conformações proteicas.</p><p>Importância das cadeias laterais de aminoácidos</p><p>As diferentes cadeias laterais dos aminoácidos conferem propriedades físicas e químicas</p><p>únicas (Figura 2.3 A), que são essenciais para o enovelamento de proteínas e a formação de</p><p>sítios de ligação ou centros catalíticos em enzimas.</p><p>Em cada aminoácido, os grupos químicos presentes nessas cadeias laterais podem</p><p>modular características, como: hidrofobicidade, volume, acidez, carga elétrica (ionização),</p><p>além de promover ligações entre cadeias peptídicas por pontes de hidrogênio ou ligações</p><p>covalentes.</p><p>De acordo com as características conferidas por suas cadeias laterais, os aminoácidos</p><p>podem ser agrupados de variadas maneiras. Um modo de classificação é por grupos</p><p>químicos (alifáticos, aromáticos, ácidos, básicos). Por exemplo, em pH fisiológico, as cadeias</p><p>laterais de cinco aminoácidos apresentam cargas elétricas diferenciadas: arginina, histidina e</p><p>lisina possuem grupo amina (ou imidazol, no caso da histidina) e apresentam cargas</p><p>positivas, sendo assim básicas; e os aminoácidos ácido aspártico e ácido glutâmico possuem</p><p>carboxilas, que no pH fisiológico apresentam cargas negativas. Portanto, como os próprios</p><p>nomes indicam, são ácidos.</p><p>Uma classificação muito comum é através da polaridade das cadeias laterais (Figura 2.4),</p><p>uma vez que essa propriedade está relacionada com o enovelamento de peptídios em</p><p>ambiente aquoso. Assim os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com suas cadeias</p><p>laterais em: não polares; polares não carregados e polares carregados (grupo que contém os</p><p>aminoácidos ácidos e básicos).</p><p>Figura 2.3 A. Estrutura geral dos alfa-aminoácidos: R representa a cadeia lateral. No detalhe estão</p><p>ilustrados os dois enantiômeros possíveis dos alfa-aminoácidos. B. Formação da ligação peptídica,</p><p>indicada em sombreado, pela união de dois aminoácidos e formação de uma molécula de água.</p><p>Figura 2.4 Moléculas dos 20 aminoácidos encontrados nas proteínas. As cadeias laterais,</p><p>responsáveis por certas propriedades químicas dos aminoácidos, estão indicadas pelo sombreado. O</p><p>grupo vermelho contém os aminoácidos apolares, o grupo azul contém os aminoácidos polares não</p><p>carregados, e o grupo verde, os aminoácidos polares carregados.</p><p>A importância biológica dessas interações e ligações de baixa energia consiste no fato de que elas</p><p>possibilitam à célula alterar, montar e desmontar estruturas supramoleculares, como os microtúbulos e os</p><p>microfilamentos, aumentando, assim sua versatilidade e eficiência funcional, sem grande gasto energético. Se as</p><p>interações das macromoléculas fossem realizadas apenas com ligações fortes, a estrutura celular seria</p><p>excessivamente estável, e as modificações dessa estrutura implicariam em gasto de energia tão alto que a</p><p>atividade celular seria impossível.</p><p>Proteínas são polímeros de aminoácidos</p><p>As proteínas são macromoléculas que contêm número variável de aminoácidos, unidos por ligações peptídicas</p><p>(ver Figura 2.3 B); são, portanto, polímeros de aminoácidos. As cadeias assim constituídas denominam-se</p><p>cadeias polipeptídicas e, ao alcançarem determinada dimensão, recebem o nome de proteína. É comum</p><p>considerar proteínas os polipeptídios com peso molecular a partir de 6.000 dáltons (dálton ou Da corresponde a 1</p><p>unidade de massa atômica).</p><p>Embora existam centenas de aminoácidos conhecidos na natureza, só 20 são encontrados nas proteínas e</p><p>estão codificados nas sequências de ácidos nucleicos (ver Figura 2.4). Os aminoácidos que compõem as</p><p>proteínas têm em comum a presença de um grupo NH2 (amino) e um grupo COOH (carboxila), ligados ao</p><p>carbono alfa da molécula (ver Figura 2.3). São exceções a prolina e a hidroxiprolina, que contêm o grupo NH</p><p>(imino) em substituição ao grupo NH2. Na realidade, a prolina e a hidroxiprolina são iminoácidos (ver Figura</p><p>2.4), mas se incluem entre os aminoácidos por apresentarem propriedades semelhantes.</p><p>Durante o processo de tradução (ver Capítulo 12), a síntese de uma proteína segue informações contidas no</p><p>ácido ribonucleico mensageiro (mRNA), e a formação das ligações peptídicas ocorre entre o grupo carboxila de</p><p>um aminoácido já na cadeia e um grupo amina de um novo aminoácido sendo adicionado, assim, o sentido da</p><p>síntese de uma proteína é da extremidade amina (N-terminal) para a extremidade carboxílica (C-terminal), ou</p><p>seja, o primeiro aminoácido de uma cadeia peptídica tem um grupo amina exposto (N-terminal), e o último</p><p>apresentará um grupo carboxílico (C-terminal). Após a formação de ligações peptídicas, os aminoácidos</p><p>envolvidos podem ser intitulados de resíduos de aminoácidos, ou apenas resíduos, uma vez que ocorre a perda de</p><p>dois átomos de hidrogênio e um de oxigênio dos aminoácidos originais para</p>